Marlène Jobert étudie le dessin puis la comédie au Conservatoire de Dijon avant de monter sur la capitale pour suivre les cours de la rue Blanche et ceux de Georges Chamarat au Conservatoire de Paris. C'est la pièce de théâtre Des clowns par milliers qui révèle la comédienne aux côtés d'Yves Montand. Au cinéma, c'est Jean-Luc Godard qui lui donne sa chance en l'engageant sur le tournage de Masculin-féminin en 1966.

Parallèlement à une carrière télévisuelle assez riche (Par quatre chemins, Rue barrée, Les Chevaliers du ciel ou encore Les Dossiers de l'agence O), elle s'illustre dans quelques comédies sympathiques comme Alexandre le Bienheureux (1967) et Faut pas prendre les enfants du Bon Dieu pour des canards sauvages (1968), avant d'accéder à la célébrité en jouant face à Charles Bronson dans Le Passager de la pluie (1969) de René Clément.

Donnant la réplique à des monstres sacrés américains comme Kirk Douglas dans La Poudre d'escampette (1971) et Orson Welles dans La Décade prodigieuse (id.), l'actrice aux taches de rousseur imprègne de son talent Les Mariés de l'an II (id.) et le drame sentimental Nous ne vieillirons pas ensemble (1972) de Maurice Pialat.

Créatrice de sa propre société de production MJ, elle participe activement au développement de deux films qu'elle interprète en 1974 : Juliette et Juliette et Pas si méchant que ça. Prolifique jusqu'à la fin des années 70, elle enchaîne les rôles de jeune femme tantôt entraîneuse (Le Bon et les méchants), tantôt amoureuse (Va voir maman, papa travaille), tantôt envahissante (Julie pot de colle), tantôt casse-cou (La Guerre des polices).

Marlène Jobert entame les années 80 avec L'Amour nu (1981), un mélodrame où elle campe une femme atteinte d'un cancer, avant de se faire plus rare sur les écrans. Mise à part sa prestation remarquée de mère adoptive dans la comédie Les Cigognes n'en font qu'à leur tête (1988), l'actrice se montre davantage présente à la télévision, officiant notamment pour la série Avocat d'office (1994-1996). Elle se consacre parallèlement à une collection de contes musicaux destinés aux enfants de 5 à 8 ans.

En 2007, elle reçoit un César d'honneur pour l'ensemble de son oeuvre. Elle est la mère de l'actrice Eva Green et sa nièce Joséphine Jobert est elle aussi comédienne.