Née à Rome de parents comédiens (son père, Vittorio Mezzogiorno, était une figure du cinéma transalpin), Giovanna Mezzogiorno fait des études de cinéma puis travaille quelques mois à Paris, au Centre International de Créations Théâtrales. C'est en 1997, dans Le Voyage de la mariee, que la jeune italienne fait ses débuts sur grand écran, avec une prestation qui lui vaut d'emblée les louanges de la critique.

En 1998, son rôle dans le Del Perduto amore de Michele Placido l'impose un peu plus comme l'un des grands espoirs du cinéma de son pays. De plus en plus convoitée, elle emmène, en 2001, le générique de Juste un baiser, réalisé par Gabriele Muccino, gros succès au box-office italien qui la rend très populaire auprès du grand public. Dès lors, rien ne semble résister à la jeune femme, qui s'illustre notamment dans Illia Alpi - Il piu crudele dei giorni (2002), où elle incarne la journaliste Ilia Alpi assassinée en Somalie, dans La Fenêtre d'en face (2003) ou encore dans L'Amore ritorna (2004). La comédienne joue peu mais bien, alternant comédies et drames avec une justesse qui lui apporte régulièrement de nombreuses récompenses.

Giovanna Mezzogiorno travaille un peu pour la France. D'abord avec la série télévisée Les Misérables de Josée Dayan, en 2001, où elle joue aux côtés de Gérard Depardieu et John Malkovich. Ensuite, deux ans plus tard, en apparaissant au générique de la comédie générationnelle Au secours, j'ai 30 ans ! de Marie-Anne Chazel. En 2007, l'actrice tient la vedette du long-métrage La Bête dans le coeur de Cristina Comencini et tente sa première expérience hollywoodienne avec la romance L'Amour au temps du choléra de Mike Newell.

Après avoir joué dans le film français Les Murs porteurs (2008) de Cyril Gelblat, Giovanna Mezzogiorno tient le rôle principal du drame historique Vincere de Marco Bellocchio . Elle y incarne la maitresse de Mussolini qui fut envoyée en hôpital psychiatrique afin de ne pas gêner l'ascension du dictateur italien. Le film est présenté en compétition officielle du Festival de Cannes 2009 et remporte 4 prix du syndicat national italien des journalistes (meilleure actrice, meilleur photo, meilleur montage et meilleur décors). En 2010, elle reste en Italie avec le film La Prima Linea dans lequel elle interprète une terroriste d'extrême-gauche aux côtés de Riccardo Scamarcio.