Formé au Cours Florent, Stéphane Pouplard a fait ses débuts avec l'acteur Jean-Claude Brialy. Il l'a assisté de 1993 à 1997 lors de ses festivals de théâtre et ses différentes pièces. Parallèlement, il travaille à Europe 1 en tant que journaliste spécialisé dans le cinéma et le théâtre. Puis, pendant 4 ans, il est rédacteur en chef et producteur exécutif, pour TF1 et TPS, dans la société d'Arthur, Endemol.

En 2004, il décide de se consacrer entièrement au métier d'acteur, au théâtre notamment en défendant des auteurs comme Anouilh, Pinget, Albee ou Vitrac et en prêtant sa voix au doublage et à la publicité. Fan de l'acteur Louis de Funès, il acquiert les droits de son célèbre film Pouic-Pouic qu'il co-adapte et co-produit. Cette pièce, avec Valérie Mairesse, Lionnel Astier et Eric Berger, se jouera de 2011 à 2013, notamment au théâtre des Bouffes Parisiens. Stéphane Pouplard produit et interprète également, avec sa compagnie, Génealog'hic !, un spectacle conçu à partir de textes de Carole Fréchette et Courts-circuits, un montage basé sur de courtes scènes de Jean-Michel Ribes et Roland Topor.

À l'image, il tourne pour France 2 dans la série Astrid et Raphaëlle, sous la direction de Julien Seri, et pour France 3 dans la fiction unitaire de Stéphanie Pillonca, Enquête Parallèle : Un crime presque parfait, avec David Mora et Malik Zidi. Stéphane Pouplard joue par ailleurs pour TF1 avec Muriel Robin dans la série Master Crimes et avec Isabelle Nanty dans Munch. On le voit aussi dans le feuilleton quotidien de France 2, Un si grand soleil, et en Beaumarchais dans le docu-fiction de France 5, La guerre des Trônes. Enfin pour le cinéma, il joue dans Vagabondes de Philippe Dajoux.