Après des études de lettres modernes et un passage par le Cours Florent, Audrey Tautou se lance dans la comédie dès 1995 en tournant quelques téléfilms comme Coeur de cible (TV) avec Francis Huster. Sa fraîcheur et son naturel sont aussitôt remarqués par Tonie Marshall qui lui confie son premier rôle sur grand écran, celui d'une jeune esthéticienne dans Vénus beauté (institut). Une prestation qui lui vaut le César du Meilleur espoir féminin en 2000.

Auréolée de ce succès, la comédienne tourne avec abondance : elle est à l'affiche de Voyous, voyelles de Serge Meynard, du Battement d'ailes du papillon de Laurent Firode et du Libertin de Gabriel Aghion. Mais c'est sa rencontre avec Jean-Pierre Jeunet et le film qui en découlera en 2001, Le Fabuleux destin d'Amélie Poulain, qui lui permettent de conquérir le cœur de tous les Français. Les tournages s'enchaînent alors de plus belle : amoureuse jusqu'à l'extrême de Samuel Le Bihan dans le premier long métrage de Laetitia Colombani, A la folie, pas du tout (2002), Audrey Tautou campe la petite amie de Romain Duris chez Cédric Klapisch (L'Auberge Espagnole et sa suite Les Poupées russes) et devient une charmante ingénue chez Alain Resnais (Pas sur la bouche, 2003).

En 2004, elle renoue avec le succès en collaborant à nouveau avec Jeunet sur la mégaproduction française Un long dimanche de fiançailles. Sa popularité internationale naissante lui vaut également de travailler avec des réalisateurs aussi talentueux que Stephen Frears (Dirty pretty things, 2002), Amos Kollek (Happy end, id.) et de figurer au casting de blockbusters comme Da Vinci Code (2006) avec Tom Hanks. Mais échaudée par cette dernière expérience, la belle préfère recentrer sa carrière sur un cinéma français plus léger - Hors de prix (2006) aux côtés de Gad Elmaleh - voire plus intimiste - Ensemble, c'est tout (2007) de Claude Berri. L'année suivante, elle remporte les faveurs de la cinéaste Anne Fontaine qui lui confie le rôle-titre de son biopic Coco avant Chanel, qui lui vaut sa troisième nomination au César de la meilleur actrice.

Après la mode, les cheveux ! Audrey Tautou tient un salon de coiffure dans De vrais mensonges (2010), pour lequel elle retrouve le réalisateur Pierre Salvadori, qui l'avait dirigée dans Hors de prix. Elle lutte ensuite contre les conventions sociales de la bourgeoisie des années 20 dans Thérèse Desqueyroux de Claude Miller (2011). La même année, elle s'investit dans deux drames touchants : Des vents contraires de Jalil Lespert, dans lequel elle joue une mère portée disparue, et La Délicatesse, où elle incarne une femme brisée qui se trouve un nouvel amour.

Malgré la rumeur selon laquelle l'actrice aurait décidé de mettre fin à sa carrière, Audrey Tautou continue au cinéma, figurant en 2013 dans deux films avec Romain Duris - une comédie et une histoire fantastique. Le premier correspond au troisième volet de L'Auberge Espagnole, toujours de Cédric Klapisch et intitulé Casse-tête chinois, tandis que le deuxième est une adaptation du roman L'Ecume des jours de Boris Vian, dont le film homonyme est dirigé par le toujours très créatif Michel Gondry. Elle retrouve d'ailleurs ce dernier en 2015 pour Microbe et Gasoil relatant les aventures de deux ados en marge. La même année, elle donne de sa voix pour le film d'animation franco-belge Phantom Boy. En 2016, elle tourne sous la direction du Franco-Vietnamien Tran Anh Hung dans Eternité qui retrace les destinées amoureuses de trois femmes à travers le XIXe et XXe siècles. Elle renoue ensuite avec le biopic grâce à L'Odyssée dans lequel elle est Simone Cousteau, épouse du célèbre explorateur océanographique français incarné par Lambert Wilson. 

2017 sonne l'heure des retrouvailles pour Audrey Tautou : après Dieu est grand, je suis toute petite, sorti seize ans plus tôt, et Phantom Boy, elle donne à nouveau la réplique à Edouard Baer dans la comédie loufoque Ouvert la nuit. Puis c'est Alain Chabat, croisé dans L'Ecume des jours, qu'elle retrouve dans Santa & Cie, nouvelle réalisation de l'ex-Nul où ce dernier, dans le costume de Santa Claus, va tenter de sauver Noël.