Diplômé de l'école de théâtre de Bologne, Stefano Accorsi fait ses armes d'acteur de cinéma sous la direction de Pupi Avati (Fratelli e Sorelle, 1991) et Carlo Mazzacurati (Vesna va veloce, 1996). Jouant les ados rebelles dans Jack Frusciante è uscito dal gruppo (1996), Ma génération (id.) et Radiofreccia (1998), le jeune comédien travaille également avec les réalisateurs Nanni Moretti (La Chambre du fils, 2001) et Maria de Medeiros (Capitaines d'avril, 2000). Mais c'est le succès de Juste un baiser en 2002 qui le fait véritablement connaître hors des frontières de l'Italie. Figurant au générique de films à prestige comme Romanzo Criminale (2005) ou Les Brigades du Tigre (2006), Stefano Accorsi n'en oublie pas pour autant de cultiver son image d'éternel romantique comme le prouvent ses prestations dans Une romance italienne (2005) et Un baiser s'il vous plaît (2007).

En 2006, il trouve, grâce à la réalisatrice Julie Gavras, l'un de ses plus beaux rôles, celui d'un père converti au communisme dans La Faute à Fidel, et donne, l'année suivante, la réplique à sa compagne à la ville Laetitia Casta dans le film d'aventure La Jeune fille et les loups. Apprécié par le cinéma français, il est le compagnon de Karin Viard dans Baby Blues (2008) puis le confident de Sylvie Testud dans Je ne dis pas non (2009), deux rôles pour lesquels son physique de séducteur est mis à contribution. Expatrié en France, il n'oublie pas sa patrie natale et, en 2010, retrouve l'équipe de Juste un baiser dans sa suite, Encore un baiser, réalisée à nouveau par Gabriele Muccino.

Le comédien, qui choisit judicieusement ses projets, intègre la saison 4 de Mafiosa en 2012 dans le rôle d'Enzo. Il donne ensuite la réplique à Margherita Buy dans Je voyage seule avant de retourner du côté de la petite lucarne en 2015 dans 1992 / 1993, une série dramatique sur fond de mafia et de politique. Il reprend son rôle de Leonardo Notte dans la saison 2, tournée en 2017. L'année suivante, Stefano se glisse dans la blouse d'un psychiatre dans Fortunata, une chronique sociale dans laquelle s'illustre Jasmine Trinca.