Julia Stiles débute à 11 ans sur les planches des célèbres théâtres La Mama Theatre et Kitchen Theatre de New York, avant de faire sa première apparition à l'écran en 1993 dans le clip Sally's Pigeons de Cindy Lauper. Au cinéma, c'est dans I love you, I love you not (1996) qu'on la découvre, film qui révéla également Claire Danes, James Van Der Beek et Jude Law, et dans Ennemis rapprochés où elle campe la fille d'Harrison Ford.

A l'âge de 17 ans, elle tient seule l'affiche du thriller indépendant Wicked, petit film avec lequel elle fait sensation au festival de Sundance. Elle tourne la même année sous la direction de M. Night Shyamalan - avant le carton de Sixième sens - dans la comédie dramatique familiale Wide Awake. C'est en 1999 que la jeune femme connaît son premier succès public grâce au teen movie 10 Bonnes raisons de te larguer, où elle incarne la représentation moderne de La Mégère apprivoisée de William Shakespeare dans une faculté américaine. Elle y donne la réplique aux stars montantes Joseph Gordon-Levitt et Heath Ledger. 

Rendue célèbre grâce à ce film, la jeune actrice surfe sur la vague du succès en continuant à se produire dans des remakes actualisés de pièces du dramaturge anglais. On la découvre ainsi dans le rôle de la pauvre Ophélie, folle amoureuse d'Hamlet / Ethan Hawke en 2000, puis dans celui de Desi Grable dans Othello 2003, transfuge moderne du personnage de Desdemone.

Elle est alors, à l'instar de ses partenaires de jeu Josh Hartnett (Othello 2003) et Freddie Prinze Jr. (La Fille de mes rêves), la coqueluche des adolescents. Un statut renforcé par le succès de Save the last dance (2001), où elle interprète une jeune adolescente passionnée de danse qui découvre le hip-hop et s'éprend d'un camarade de lycée afro-américain. Le film engrange plus de 90 millions de dollars de recettes rien qu'aux Etats-Unis.

Elle parvient à se détacher de son image d'ado avec des productions hétéroclites comme le rétro Le Sourire de Mona Lisa qui la plonge dans les années 50 aux côtés de Kirsten Dunst et de Julia Roberts, la trilogie d'action Jason Bourne portée par Matt Damon (La Mémoire dans la peau (2002), La Mort dans la peau (2003) et La Vengeance dans la peau (2007)), et l'horrifique 666 La Malédiction, remake du classique de Richard Donner.

En 2010, elle rejoint le casting de la série la plus regardée de la chaîne câblée Showtime, Dexter, pour la cinquième saison. Elle interprète une victime de viol qui se transforme en une redoutable prédatrice. À partir de cette période, sa carrière se partage aussi bien entre les séries (Blue, Riviera, The Lake) que le cinéma, même si elle participe à des films qui passent relativement inaperçus (Closed Circuit, Out of the Dark, La fabuleuse Gilly Hopkins, Manipulations ou 11:55), à l'exception d'Happiness Therapy (2012), Jason Bourne (2016), quatrième volet consacré aux aventures de l'espion amnésique, et Queens (2019), sur un groupe de strip-teaseuses reines de l'arnaque. En 2022, elle est confrontée à une inquiétante petite fille dans Esther 2 : les origines, suite du film de Jaume Collet-Serra.