Etudiant à l'Université de Californie du Sud, Topher Grace est repéré en 1998 par Bonnie Turner pour son rôle de Pseudolus dans une pièce de théâtre. Agé de 20 ans, il décide alors d'abandonner la faculté pour suivre une carrière d'acteur, et il est engagé pour le rôle principal de la série (désormais culte) That 70's Show, créée par Turner. Il y interprète le rôle d'Eric Forman pendant sept ans, de 1998 à 2005, aux côtés d'Ashton Kutcher.

Parallèlement, il débute sur grand écran en 2000 avec un petit rôle dans le multi-récompensé Traffic de Steven Soderbergh, où il donne la réplique à Michael Douglas. A cette occasion, il remporte deux prix d'interprétation, dont celui du meilleur espoir masculin aux Young Hollywood Awards de 2001. Par la suite, il participe à un autre film de Soderbergh, Ocean's Eleven, puis apparaît dans Le Sourire de Mona Lisa avec Julia Roberts. En 2004, il obtient l'un des deux rôles principaux, avec Dennis Quaid, de la comédie douce-amère En bonne compagnie, où il joue un jeune cadre dynamique amoureux de la fille de son employé, interprétée par Scarlett Johansson.

En 2007, il retrouve l'actrice Kirsten Dunst, présente au générique du Sourire de Mona Lisa, pour le troisième opus de Spider-Man, en incarnant le rival de Peter Parker, Eddie Brock / Venom. La même année, il se lance dans la production avec Gordon Kaywin pour le long métrage Kids in America, qu'il a imaginé avec Kaywin et dans lequel il a le premier rôle. Trois ans après, l'acteur mélange de nouveau les genres, de la comédie Valentine's Day sous la direction de Garry Marshall, au film de science-fiction Predators, sous celle de Nimrod Antal.

A l'affiche du déjanté Une soirée d'enfer en 2011, Topher Grace côtoie Richard Gere dans le thriller Secret Identity, Robert De Niro dans la comédie Un grand mariage, Jesse Eisenberg dans la comédie d'action American Ultra et Cate Blanchett dans Truth : Le Prix de la vérité, qui dévoile les coulisses d'un scandale télévisuel majeur. En 2018, on le retrouve dans deux films plébiscités par la critique : BlacKkKlansman : J'ai infiltré le Ku Klux Klan de Spike Lee et Under the Silver Lake du réalisateur de It Follows David Robert Mitchell.