Après des études à l'Université de Columbia, Maggie Gyllenhaal fait ses premiers pas d'actrice sur scène, à Londres et New York. C'est en 1992 qu'elle débute sur grand écran, dans le drame Waterland, réalisé par son père Stephen Gyllenhaal. Ce dernier accompagnera son début de carrière, lui donnant l'opportunité de s'aguerrir dans des téléfilms et deux autres longs métrages, A dangerous woman (1993) et Homegrown (1998).

Après un petit rôle dans le Cecil B. DeMented de John Waters, l'actrice se révèle au grand public en 2001 en jouant aux côtés de son frère Jake Gyllenhaal dans le mystérieux thriller Donnie Darko, réalisé par Richard Kelly. L'année suivante, elle interprète le premier rôle du sulfureux La Secrétaire, film qui la révèle au grand public et impose un visage angélique, mélange de naïveté et de sévérité. Ce rôle lui vaut d'ailleurs une première nomination au Golden Globe de meilleure actrice.

La suite de sa carrière confirme son goût pour un cinéma ambitieux, notamment avec Adaptation (2002) et Confessions d'un homme dangereux (2002), même si les œuvres plus grand public et plus légères que sont Ecarts de conduite et Le Sourire de Mona Lisa viennent prouver son goût d'éclectisme. En 2004, Maggie Gyllenhaal est l'une des arnaqueuses de Criminal, remake hollywoodien du thriller argentin Les Neuf Reines.

En 2006, la comédienne s'essaye au doublage en prêtant sa voix à la baby-sitter Zee dans la version originale de Monster House, la première collaboration "animée" de Steven Spielberg et Robert Zemeckis. La même année elle tourne aux côtés de Nicolas Cage sous la direction d'Oliver Stone dans World Trade Center avant de rejoindre Julianne Moore, David Duchovny et Billy Crudup dans la comédie romantique de Bart Freundlich, Trust the Man. Cette même année, elle accepte le rôle principal dans SherryBaby, où elle interprète une jeune mère sortie de prison qui cherche à reprendre la garde de sa petite fille. L'actrice est encore une fois nommée aux Golden Globes, et remporte le prix d'interprétation au festival de Karlovy Vary.

Les années qui suivent sont encore marquées par des choix variés, comme les comédies indépendantes SherryBaby (2006) et Away We Go (2009), le drame Crazy Heart (2009), pour lequel elle est nominée aux Oscars, le film pour enfants Nanny McPhee et le big bang (2010), écrit et interprété par Emma Thompson, et surtout la très grosse production The Dark Knight, Le Chevalier Noir (2008) - sans oublier sa participation dans le court-métrage High Falls (2007), très remarqué au festival de Sundance.

Toujours à l'aise dans des films à caractère sexuellement provocateur, l'actrice campe en 2012 l'héroïne de la comédie Oh My God !, sur l'invention du vibromasseur... Plus rare sur les écrans dans les années 2010 et privilégiant le théâtre, la native de New York s'illustre tout de même dans le drame De leurs propres ailes, le film d'action White House Down et la série The Honourable Woman, dans laquelle elle joue une femme d'affaires anglo-israélienne qui se retrouve prise à partie entre Israéliens et Palestiniens.

La comédienne incarne aussi, de 2017 à 2019, une prostituée qui devient actrice de films X dans la série HBO The Deuce, laquelle retrace l'essor de l’industrie pornographique du début des années 70 au milieu des années 80, aux Etats-Unis. En 2021, Maggie Gyllenhaal est choisie pour faire partie du jury du 74ème festival de Cannes, présidé par le célèbre cinéaste engagé Spike Lee.