Jennifer Jason Leigh abandonne ses études en 1981 pour participer au film d'horreur Eyes of a stranger. Mais c'est par le biais de la télévision que le public américain la remarque, notamment grâce au téléfilm The best little girl in the world, dans lequel elle partage l'affiche avec Eva Marie Saint.

En 1990, l'actrice connaît la consécration professionelle : ses performances dans les drames Miami Blues et Derniere Sortie pour Brooklyn sont saluées par la profession. Le public, quant à lui, la plébiscite dans le drame Backdraft (1991), où elle incarne la petite amie du pompier William Baldwin, et le thriller JF partagerait appartement, où elle campe l'inquiétante Hedra Carlson.

Jennifer Jason Leigh devient une actrice incontournable dans les années 90, adoptant des rôles de femmes manipulatrices ou glaciales, et travaillant avec les plus grands réalisateurs de sa génération : Robert Altman pour Short Cuts en 1993, les frères Joel et Ethan Coen pour Le Grand Saut en 1994 ou encore David Cronenberg en 1999 pour le film d'anticipation eXistenZ. Privilégiant les films à tonalité dramatique, elle s'illustre dans Dolores Claiborne, adapté de Stephen King, et reçoit un accueil chaleureux du milieu indépendant pour son rôle dans Mrs Parker et le cercle vicieux.

Après Le Roi est vivant, qu'elle tourne dans les conditions Dogme, Jennifer Jason Leigh collabore avec son ami Alan Cumming pour écrire, produire, réaliser et interpréter la comédie acide The Anniversary Party. Sam Mendes fait ensuite appel à la comédienne afin qu'elle rejoigne la distribution des Sentiers de la perdition, film noir emmenée par Tom Hanks. En 2003, Jennifer Jason Leigh s'illustre dans le thriller érotique In the cut au côté de Meg Ryan. L'actrice enchaîne avec l'hypnotique The Machinist en 2004, où elle interprète une prostituée aux côté d'un Christian Bale méconnaissable. L'année suivante, son interprétation d'une mère manipulatrice dans la comédie Childstar lui a valu un Prix Génie en 2005 (une récompense canadienne).

Elle poursuit avec le rôle d'un médecin dans The Jacket, un film mêlant le thriller et la science fiction avec Adrien Brody, avant de tourner dans la comédie dramatique Margot va au mariage en 2007, sous la direction de son mari Noah Baumbach. Après une incursion vers la télévision (elle interprète la soeur de Marie-Louise Parker dans plusieurs épisodes de Weeds), Jennifer Jason Leigh partage avec Ben Stiller l'affiche de Greenberg, comédie dramatique du même Noah Baumbach, produite et co-écrite par l'actrice elle-même. 

Après avoir été à l'affiche de films plutôt méconnus, dont deux avec Kristen Wiig, Hateship Loveship et Welcome to Me, la comédienne tourne dans le nouveau Quentin Tarantino, le western au casting très "tarantinien" Les Huit salopards.