Fille de fonctionnaires, Clotilde Hesme grandit dans une commune rurale. Sa formation de comédienne passe par la classe libre du Cours Florent puis le Conservatoire National d'Art Dramatique, où elle a pour professeurs Daniel Mesguich et Catherine Hiegel. Eprise de théâtre, elle connaît ses premières expériences de tournage en participant à un court métrage avec Gad Elmaleh en 1999 puis à un clip d'Alain Chamfort signé Patrice Leconte.

Aperçue dans Le Chignon d'Olga (2001) et A ce soir., Clotilde Hesme est choisie par Philippe Garrel (avec qui elle travailla au Conservatoire) pour former avec son fils Louis le couple central des Amants réguliers (2005). Avec son mélange de fraîcheur et de mélancolie, l'actrice illumine cette évocation intimiste de Mai 68. Toujours en compagnie de Louis Garrel, elle déambule dans le Paris d'aujourd'hui vu par Christophe Honoré : c'est Les Chansons d'amour, film sentimental et musical présenté à Cannes en 2007. La même année, elle promène son charme et sa fantaisie sur les routes de campagne traversées par Le Fils de l'épicier.

La comédienne affirme son statut auprès de réalisateurs exigeants et aguerris tels Bertrand Bonello (De la guerre, 2008) ou les frères Larrieu (Les Derniers jours du monde, 2009), tout en maintenant une collaboration étroite avec Christophe Honoré qu'elle retrouve à la fois au théâtre lors du Festival d'Avignon et pour son adaptation revisitée de la Princesse de Clèves, La Belle Personne. Elle prend l'année suivante la direction du Portugal où elle s'immerge dans les Mystères de Lisbonne, qui lui offre une première collaboration avec un réalisateur étranger, le chilien Raoul Ruiz. Son amie la réalisatrice Alix Delaporte fait appel à elle pour jouer une histoire d'amour compliquée dans Angèle et Tony. Pour ce rôle, elle remporte le César du Meilleur Espoir féminin.

Désormais récompensée par la profession, Clotilde Hesme continue de tourner pour le cinéma tout en menant de front ses différents projets au théâtre. En 2012, elle est à l'affiche du drame Trois Mondes de Catherine Corsini mais surtout elle est Adèle, l'un des personnages phares de la série à succès Les Revenants. Après son César, ce rôle lui permet à nouveau d'élargir son public. A l'affiche du mélodrame Pour une femme de Diane Kurys, elle se voit de nouveau offrir un rôle par Alix Delaporte dans Le Dernier coup de marteau, où elle retrouve Grégory Gadebois, son complice de Angèle et Tony. Pour ce rôle de femme atteinte d'un cancer, la comédienne n'hésite pas à se raser le crâne. Sa prestation est unanimement saluée et elle remporte le prix de la Meilleure actrice au Festival international du film de Marrakech 2014.

Actrice tant à l'aise dans le drame que des registres plus légers, on la retrouve dans le rôle d'Eva, une jeune femme fantasque dans L'Echappée Belle, premier film d'Emilie Cherpitel. On la verra prochainement à l'affiche du film historique Chocolat de Roschdy Zem, biopic sur Chocolat qui fut le premier clown noir de la scène française, et dans lequel elle donnera la réplique à Omar Sy.