Après des études d'art dramatique à New York, Tim Blake Nelson débute sa carrière au cinéma en 1992 avec une apparition dans la comédie Ma vie est une comédie, première réalisation de Nora Ephron, avant d'enchaîner sur Amateur de Hal Hartley deux ans plus tard.

Limité à de petits rôles, comme dans Donnie Brasco de Mike Newell en 1997 ou La Ligne rouge de Terrence Malick en 1998, il se tourne vers la réalisation et adapte sa propre pièce de théâtre en 1997 avec Eye of god, récompensé au Festival de Sundance la même année. Parallèlement à ses travaux derrière la caméra, Tim Blake Nelson continue de se faire une place parmi les grands seconds rôles du cinéma américain.

C'est en 2000 qu'il est remarqué par le grand public en suivant George Clooney dans son odyssée O'Brother réalisée par Ethan et Joel Coen. Suivent notamment le drame indépendant The Good girl (2002), remarqué au festival de Sundance et le thriller futuriste Minority report (id.) de Steven Spielberg. En 2003, son drame Othello 2003, ré-actualisation du Othello de Shakespeare réalisé deux ans plus tôt, sort dans les salles françaises.

Souvent choisi pour ses talents comiques, il apparaît dans de nombreuses comédies dont Scooby-Doo 2 : les monstres se déchaînent (2004) et Mon beau-père, mes parents et moi (2005). Il confirme toutefois son statut d'artiste indépendant en 2006 dans le thriller politique Syriana, où il partage une nouvelle fois l'affiche avec George Clooney. En 2009, il dirige Edward Norton dans son troisième film Escroc(s) en herbe.

L'acteur se tourne vers l'un de ses premiers blockbusters avec L'Incroyable Hulk (2008), sans pour autant oublier les films un peu plus confidentiels comme American Violet (2008) ou Saint John Of Las Vegas (2009). En 2011, Tim Blake Nelson fait un tour dans le second film de Tony Kaye, Detachment, avant de remonter le temps jusqu'à la Guerre de Sécession pour Lincoln (2012) réalisé par Steven Spielberg.

Tournant beaucoup, Tim fait office de second rôle plus ou moins marquant dans le film familial Miracle en Alaska, les thrillers Child of God et Nightmare Alley, les westerns The Homesman et La Balade de Buster Scruggs, le drame The Sound and the Fury, les blockbusters Les Quatre Fantastiques et Captain America: Brave New World, le film d'action La Chute du Président, les biopics Selma et La Voie de la justice, et la comédie d'action Ghosted.

Le natif de Tulsa campe également le personnage principal du western disponible sur Prime Video Old Henry. Parallèlement, Tim apparaît dans les séries Unbreakable Kimmy Schmidt, Wormwood, Watchmen et Le Cabinet de curiosités.