Fille de Roberto Rossellini et d'Ingrid Bergman, Isabella Rossellini commence sa carrière en tant qu'habilleuse sur les films de son père pour bientôt apparaître sur la RAI, chaîne de télévsion italienne où elle devient vedette d'une émission comique. Elle mène en parallèle une carrière de mannequin en devenant l'égérie de la marque Lancôme.

Elle débute au cinéma à l'âge de 20 ans en tournant dans des longs métrages italiens (Le Pré et Il Pap'occhio), mais elle est surtout révélée au grand public dans des films américains comme Soleil de nuit, et surtout Blue Velvet de David Lynch. Son interprétation de la chanteuse sadomasochiste Dorothy Valens lui permet de gagner des rôles de femmes torturées à la beauté glaciale. Des rôles de femmes atypiques qu'on retrouve aussi bien dans Cousins, Dames galantes, La Mort vous va si bien et même dans le sulfureux Sailor et Lula du même David Lynch où elle interprète une belle Mexicaine aguicheuse.

Dans son propre rôle, le temps d'un épisode de la saison 3 de Friends, elle devient le fantasme de Ross, lui faisant même oublier Jennifer Aniston ! Durant les années 90, sa carrière se partage entre des films américains et italiens (Le Diable à quatre, Ludwig Van B., Nos funérailles, etc.).

Elle accumule en outre les seconds rôles dans des productions qui ne rencontrent guère de succès (Les imposteurs, Empire, Un mari de trop, etc.) tout en se diversifiant dans des séries populaires comme Alias, Chicago Hope ou encore 30 Rock où elle incarne l'ex-femme complètement déjantée d'Alec Baldwin.

En 2007, elle joue dans Scandaleusement célèbre, nouveau biopic consacré au célèbre auteur Truman Capote déjà immortalisé à l'écran par Philip Seymour Hoffman l'année précédente. Après des apparitions chez James Gray (Two Lovers), Julie Gavras (3 fois 20 ans), Marjane Satrapi (Poulet aux prunes), elle retrouve en 2012 le réalisateur indépendant Guy Maddin, avec qui elle avait tourné The Saddest Music in the World et Des trous dans la tête, pour Ulysse, souviens-toi !, un récit mystérieux sur un homme confronté à son passé.

En 2013, la comédienne incarne la mère de Jake Gyllenhaal dans le mystérieux thriller Enemy de Denis Villeneuve. La même année, elle réalise et interprète une série de courts métrages sur le thème de la maternité, Mammas, avant de jouer dans un épisode de la série policière Blacklist aux côtés de James Spader.

Le Festival de Cannes met la belle Isabella à l'honneur en 2015 en la choisissant pour présider le jury de la sélection Un Certain Regard. C'est d'autant plus symbolique que le Festival rend hommage à sa mère, Ingrid Bergman, égérie de cette nouvelle édition du rendez-vous incontournable du cinéma mondial.