Alfred Molina compte à son actif plus d'une soixantaine de films, de productions télévisées et de pièces de théâtre. Étudiant à la "Guildhall School of Music" de Londres, il fait ses premiers pas sur les planches de la capitale anglaise au sein de la "Royal Shakespeare Company" qu'il intègre en 1977, avant d'être remarqué quatre ans plus tard dans Les Aventuriers de l'Arche perdue. Ses origines espagnoles (par sa mère) et italiennes (par son père) lui permettent souvent d'endosser des rôles typés : après Ladyhawke, la femme de la nuit (1985) de Richard Donner, l'acteur incarne le terrifiant père de famille iranien de Jamais sans ma fille en 1991.

Cantonné aux seconds rôles et véritable camélon, l'acteur accumule les prestations sur le petit et le grand écran. Alfred Molina retrouve Richard Donner dans Maverick en 1994, puis apparaît dans Dead Man de Jim Jarmusch (1995) et La Mutante de Roger Donaldson en 1995. Deux ans plus tard, le comédien rencontre Paul Thomas Anderson qui lui offre un rôle de dealer dans son premier long métrage, Boogie Nights, avant de l'enrôler dans Magnolia. Comte de Reynaud dans Le Chocolat de Lasse Hallström en 2000, Alfred Molina incarne Diego Rivera, le mari de Frida Kahlo, dans Frida de Julie Taymor, pour lequel il n'hésite pas à se transformer physiquement en prenant du poids.

En 2002, il joue un médecin pour Identity et apparaît dans Coffee and cigarettes de Jim Jarmusch. Choisi par Sam Raimi après le visionnage de Frida, il fait l'année suivante sa première incursion dans l'univers des Comics, en interprétant à l'écran le rôle très physique du terrifiant Dr Octavius dans la suite des aventures de l'homme-araignée, Spider-Man 2. Il prend la tête d'affiche de la comédie grinçante et décalée L'Amour, six pieds sous terre en 2004, avant de retrouver Lasse Hallström sur le tournage de Faussaire l'année suivante. Il continue d'incarner les seconds rôles charismatiques dans ses différents projets, comme celui du mystérieux Evêque Aringarosa du Da Vinci code, film de Ron Howard ouvrant le festival de Cannes 2006.

Alfred Molina a également tourné dans un grand nombre de téléfilms, parmi lesquels Joan of Arc (TV) et Murder on the Orient Express (TV), avant d'achever en 2006, le tournage de la mini-série The Company, produite par Ridley Scott.

Après avoir participé en 2007 à Soie, adaptation du roman éponyme d'Alessandro Baricco, il tient le haut de l'affiche en 2008 dans une réécriture de Jack l'éventreur, The Lodger, inédit en France. L'année d'après, il la partage avec Peter Sarsgaard et Carey Mulligan dans le coup de cœur du festival de Sundance, Une éducation, et voit sa performance récompensée par une nomination aux Bafta Awards. Son désir d'alterner grosse production et projet plus personnel se confirme en 2010 avec Prince of Persia : les sables du temps et The Tempest, ou comment passer d'un jeu vidéo grand public à l'adaptation d'une pièce de Shakespeare.

Durant les années 2010, Alfred Molina privilégie les séries, que ce soit dans le registre du comique (Roger & Val Have Just Got In), du médical (Monday Mornings), du policier (Los Angeles Police judiciaire), de l'action (Matador), du biopic (Show Me a Hero) et surtout de l'animation (il double des personnages de Dragons : Par-delà les rives, Robot Chicken, Mages et sorciers: Les contes d'Arcadia, La Colo magique ou encore Maya and the Three). Il n'en oublie toutefois pas le cinéma. Acteur très actif, on le voit dans L'Apprenti sorcier, Identité secrète, Aux yeux de tous, Love is Strange, A Family Man ou Promising Young Woman.

En 2021, le natif de Londres reprend l'un de ses personnages les plus célèbres : le Docteur Octopus dans Spider-Man: No Way Home.