William H. Macy se découvre une passion pour le théâtre au Bethany College où il étudie la médecine vétérinaire. Il s'inscrit alors à l'université Goddard, dans le Vermont, où il a comme professeur de théâtre David Mamet. En 1972, William H. Macy, David Mamet et son compagnon d'écriture Steven Schachter s'installent à Chicago, où ils fondent le Théâtre St. Nicholas.

En 1980, William H. Macy fait sa première apparition au cinéma dans Quelque part dans le temps de Jeannot Szwarc. Il y interprète un critique. Mais il devra attendre les années quatre-vingt-dix pour se voir accorder des rôles plus intéressants au cinéma. En 1991, David Mamet fait appel à lui pour incarner Tim Sullivan, le coéquipier à l'écran de Joe Mantegna, dans son film policier Homicide. Dès lors, il enchaîne les petits rôles marquants : celui d'un principal adjoint dans Professeur Holland, d'un pilote chargé de la protection d'Harrison Ford, Président des Etats-Unis dans Air Force One (1997), d'un agent de la CIA dans Des hommes d'influence.

En 1997 vient la consécration : William H. Macy est cité à l'Oscar et à l'Independent Spirit Award du meilleur second rôle pour son interprétation du vendeur de voitures Jerry Lundegaard dans Fargo de Ethan et Joel Coen. Son visage devient familier pour le grand public. Il tourne à deux reprises sous la direction de Paul Thomas Anderson dans Boogie nights (1998) et Magnolia (1999), deux films dans lesquels il compose des personnages à l'air abattu et dépassés par les événements. Parallèlement, William H. Macy s'illustre dans la comédie : il incarne le super héros "La Pelle" dans Mystery men (1999), le shérif Chappy Dent dans Happy, Texas (2000) ainsi qu'un cambrioleur bras cassé dans Bienvenue à Collinwood (2002).

Dès 2001, il s'impose en tête d'affiche du blockbuster Jurassic Park III et de Panic, où il campe un tueur à gages n'ayant pas la conscience tranquille. Il continue sur sa lancée en portant la poisse aux joueurs de poker dans Lady chance (2004) et en traquant Jason Statham dans le thriller "téléphonique" Cellular. Après avoir interprété le sénateur Ortolan Finistirre dans Thank you for smoking (2005) et participé à l'INLAND EMPIRE de David Lynch, il fait office de second rôle dans des films comme Bande de sauvages (2007), Shorts (2008), Marmaduke (2010), La Défense Lincoln (2011), The Sessions (2012), Cake (2014), Room (2015) et Blood Father (2016). Il passe aussi derrière la caméra et signe The Layover (2017) et Krystal (id.)

C'est toutefois du côté des séries qu'il trouve ses personnages les plus importants. Ainsi, de 2011 à 2021, William se glisse dans la peau de Francis Gallagher, le patriarche de la famille Gallagher qui passe son temps à boire. On le voit aussi en 2022 dans la mini-série The Dropout, centrée sur l'ascension et la chute de la plus jeune milliardaire autoproclamée du monde, Elizabeth Holmes. En 2024, il apparaît dans la comédie Ricky Stanicky de Peter Farrelly et le blockbuster La Planète des Singes : Le Nouveau Royaume.