Fille de journaliste, Marie Gillain grandit à la campagne. S'adonnant très tôt à la danse et à la comédie, cette passionnée de cirque intègre à 14 ans une troupe de théâtre amateur de Liège, avant de passer des essais pour L' Amant de Jean-Jacques Annaud. Même si elle n'est pas retenue pour le rôle féminin principal, Marie Gillain ne tarde pas à être révélée au cinéma grâce au succès de Mon père ce héros (1991), une comédie de Gérard Lauzier dans laquelle elle incarne, à 16 ans, la fille délurée de Gérard Depardieu. Une performance qui lui vaut une nomination au César du Meilleur espoir féminin.

Vue en 1993 dans le téléfilm Un homme à la mer de Jacques Doillon, Marie Gillain devient l'héroïne de L'Appât (1995) de Bertrand Tavernier, récit de la dérive criminelle de trois jeunes gens. Grâce à sa composition d'ado inconsciente, elle décroche le prix Romy Schneider en 1996. A la même période, elle fait des débuts très remarqués sur les planches dans Le journal d'Anne Frank, une prestation qui lui vaudra une nomination au Molière de la Révélation théâtrale. Au cinéma, elle donne la réplique à Isabelle Huppert dans Les Affinités électives des frères Taviani, mais c'est avec un autre film d'époque, Le Bossu, qu'elle obtient de nouveau les faveurs des spectateurs. Gracieuse et téméraire, elle y manie l'épée aux côtés de Daniel Auteuil.

Alternant cinéma d'auteur (Le Dîner (1998) d'Ettore Scola et Le Dernier harem (1999) de Ferzan Ozpetek) et films grand public (Barnie et ses petites contrariétés, Absolument fabuleux), Marie Gillain retrouve Bertrand Tavernier pour les besoins de Laissez-passer (2002) et rejoint le clan Klapisch pour le polar Ni pour, ni contre (bien au contraire) (id.). Tournant avec parcimonie (Tout le plaisir est pour moi en 2004, L'Enfer en 2005) pour cause de grossesse - elle ne peut participer au tournage de Holy Lola de Bertrand Tavernier -, elle effectue en 2007 son grand retour au cinéma avec pas moins de trois longs métrages : l'adaptation du roman Pars vite et reviens tard de Fred Vargas, le film chorale Fragile(s) et la comédie romantique décalée La Vie n'est pas une comédie romantique.

En 2008, elle donne la réplique à Roschdy Zem et Jean-Paul Rouve en interprétant Mélanie dans La Très très grande entreprise sous la direction de Pierre Jolivet, avant de prêter sa voix à la Tigresse dans le film d'animation Kung Fu Panda pour la version française. S'imposant de plus en plus dans le cinéma français en tant que femme "adulte", on lui propose des rôles plus intenses, plus engagés comme celui de Suzy dans Les Femmes de l'ombre, ou d'Adrienne Chanel dans Coco avant Chanel, avec Audrey Tautou.

Marie Gillain retrouve en 2011 son personnage "vocal" de la Tigresse (dont Angelina Jolie est la voix originale) dans Kung Fu Panda 2, toujours en compagnie de Manu Payet. Elle partage ensuite l'affiche de Toutes nos envies, drame qui nous plonge dans le milieu juridique, avec Vincent Lindon devant la caméra de Philippe Lioret.