Diane Keaton étudie l'art dramatique à l'université de Californie. Partie à New York en quête de travail, elle trouve son premier rôle à Broadway, dans la comédie musicale Hair. C'est également à Broadway qu'elle fait la rencontre en 1970 d'un jeune metteur en scène nommé Woody Allen, qui l'engage pour jouer dans sa pièce, Play it again, Sam. La même année, elle fait ses premiers pas sur grand écran dans Lune de miel aux orties. Deux ans plus tard, Woody Allen fait à nouveau appel à elle pour l'adaptation cinématographique de sa pièce.

La même année, elle se fait remarquer grâce au film de Francis Ford Coppola, Le Parrain. Avec le personnage de Kay, la compagne de Al Pacino, elle incarne une certaine pureté dans le milieu mafieux. Elle reprendra ce rôle deux ans plus tard dans Le Parrain, 2ème partie, et en 1990 dans Le Parrain, 3e partie. Elle trouve dans les films de Woody Allen ses meilleurs rôles, dont les comédies Woody et les robots (1973) et Guerre et amour (1975). Elle échappe le temps d'un film au monde du cinéaste new-yorkais pour celui plus sombre et plus désespéré de A la recherche de Mr Goodbar (1977), où elle croise Richard Gere.

Néanmoins, le premier vrai tournant de sa carrière s'intitule Annie Hall. Grâce à ce film de Woody Allen où elle incarne une amoureuse angoissée, elle remporte l'Oscar et le British Award de la meilleure actrice et devient, contre toute attente, une star à la mode, bien différente des canons hollywoodiens. Avant leur rupture, ils tournent encore deux autres films : Intérieurs (1978) et Manhattan (1979). "Emancipée" des rôles de jeunes femmes peu aguichantes, elle interprète, sous la direction de Warren Beatty, un personnage plus séducteur dans Reds (1981), pour lequel elle est nommée à l'Oscar et au Golden Globe.

Les années 80 sont une période moins faste pour Diane Keaton. Elle apparaît dans quelques films, alternant drames et comédies. Les années 90 la voient s'investir dans des films populaires comme Le Père de la mariée (1991). Cependant, elle renoue avec le succès lors de ses retrouvailles avec Woody Allen qui ont lieu en 1993 sur le tournage de la comédie dramatique Meurtre mysterieux a Manhattan qui reçoit un bel accueil. En 1996, dans un registre plus grave, elle partage la vedette avec un débutant encore inconnu, Leonardo DiCaprio, dans le film Simples Secrets. Loin des personnages de bourgeoises hystériques, elle y interprète une femme malade atteinte d'un cancer.

Depuis quelques années, elle s'illustre principalement dans des comédies. On la retrouve notamment en 2004 dans Tout peut arriver, une comédie romantique aux côtés de Jack Nicholson ou dans Esprit de famille (2005) avec Sarah Jessica Parker et Rachel McAdams. Elle retrouve d’ailleurs l’actrice canadienne dans Morning Glory en 2011 où elle incarne la présentatrice d’une émission télé matinale qui n’a pas peur du ridicule.

Parallèlement à sa carrière d’actrice, Diane Keaton manifeste dès 1987 des velléités de mise en scène : elle réalise le documentaire Heaven consacré aux croyances sur l'au-delà. En 1995, elle met en scène un long métrage de fiction, Les Liens du souvenir, qui réunit Andie MacDowell et John Turturro. En l'an 2000, elle s'offre même un rôle aux côtés de Meg Ryan dans la comédie Raccroche !.