Benoît Jacquot est un jeune cinéphile de 17 ans lorsqu'il débute au cinéma comme assistant de Bernard Borderie sur un film de la série des Angélique. Au début des années 70, il tourne beaucoup pour la télévision, des documentaires (Jacques Lacan psychanalyse I et II) comme des adaptations d’œuvres de Kafka ou Blanchot.

Assistant de Duras sur Nathalie Granger et India Song, il choisit pour son premier film, L'Assassin musicien (1975), de porter à l'écran un roman de Dostoievski. La mise en scène très dépouillée et la diction atone des comédiens semblent faire de lui un héritier de Bresson, une impression que vient confirmer son deuxième opus, Les Enfants du placard. Mais le plus souvent, les films austères de Jacquot peinent à emporter l'adhésion de la critique et du public, y compris Les Ailes de la colombe (1981), ambitieuse adaptation de James avec Isabelle Huppert et Dominique Sanda. À la fin des années 80, c'est en fait grâce à ses travaux autour du théâtre, et destinés à la télévision, que le cinéaste est particulièrement remarqué, notamment grâce au limpide Elvire Jouvet 40.

Avec La Désenchantée, Jacquot prend, en 1990, un nouveau départ. Inspiré par la débutante Judith Godrèche, il signe l'émouvant portrait d'une adolescente exaltée. C'est autour d'une autre jeune comédienne, Virginie Ledoyen, qu'il construit ensuite La Fille seule (1995), oeuvre épurée qui lui vaut les éloges de la presse internationale. Avec Le Septième Ciel, il fait un nouveau pas vers le grand public et dès lors, les stars se bousculent pour être devant sa caméra : Huppert (L' Ecole de la chair, présenté à Cannes en 1998), Adjani (Adolphe) ou encore Deneuve (le téléfilm Princesse Marie).

Le sentiment amoureux est son thème de prédilection, mais Jacquot, devenu un des auteurs les plus prolifiques du cinéma français, fait surtout preuve d'un éclectisme rare : après un nouveau détour par le théâtre (la fausse captation La Fausse Suivante), il signe un film d'époque sur la vie de Sade (2000), mais aussi un opéra (Tosca). En 2004, il surprend encore en tournant en noir et blanc et en DV A tout de suite, récit d'une cavale interprété par Isild Le Besco, sa nouvelle muse, qu'il emmène ensuite en Inde à l'occasion de L'Intouchable, présenté à Venise en 2006.

Il entreprend ensuite un nouveau voyage, pour une île d'Italie cette fois, à l'occasion de Villa Amalia, adaptation du roman de Pascal Quignard, film qui marque ses retrouvailles avec Isabelle Huppert (2009). L'année suivante concrétise les impondérables de son cinéma quand il réunit pour Au fond des bois, sa compagne d'alors Isild Le Besco dans une nouvelle plongée au sein du 19ème siècle, autour d'une variation ambiguë sur le sentiment amoureux.

En 2011, le cinéaste, fidèle à son amour des films en costumes, signe Les Adieux à la reine, une fiction historique qui relate les derniers jours de la Reine Marie-Antoinette, à l'aube de la prise de la Bastille, en 1789. Pour les besoins de cette nouvelle fresque, le réalisateur dirige une belle brochette d'actrices, puisqu'il réunit devant sa caméra Léa Seydoux, Virginie Ledoyen et Diane Kruger. Après avoir esquissé nombre de portraits de femmes, Benoît Jacquot met en scène le chassé-croisé contemporain Trois coeurs (2014) avec un premier rôle masculin spécialement écrit pour l'acteur belge Benoît Poelvoorde, accompagné pour l'occasion de Charlotte Gainsbourg, Chiara Mastroianni et Catherine Deneuve.

Le réalisateur retrouve néanmoins ses motifs récurrents dans Journal d'une femme de chambre, qui lui permet à nouveau mettre en scène Léa Seydoux, puis À Jamais, qui fait cette fois découvrir au grand public la jeune Julia Roy, également scénariste du film. Il dirige celle-ci dans ses trois longs-métrages suivants, trois oeuvres sur le désir, l'amour et l'obsession : Eva (2017), Dernier Amour (2019) et Suzanna Andler (2021). Le premier est une relecture du film de Joseph Losey avec Isabelle Huppert et Gaspard Ulliel, le second transforme Vincent Lindon en Casanova, tandis que le dernier est une adaptation d'une pièce de Marguerite Duras avec Charlotte Gainsbourg. En 2022, le réalisateur livre un documentaire sur le métier de comédien en suivant les traces d'Isabelle Huppert et Fabrice Luchini dans Par coeurs. 

Le 6 février 2024, l'actrice Judith Godrèche, avec laquelle il a été en couple pendant six ans (elle avait 14 ans et lui 39 au moment de leur rencontre) porte plainte contre lui pour « viols avec violences sur mineur de moins de 15 ans » commis par personne ayant autorité. Son témoignage est suivi par celui de quatre autres comédiennes, Julia Roy, Vahina Giocante, Isild Le Besco et Laurence Cordier, qui dénoncent elles aussi dans Le Monde l'emprise du réalisateur, ses avances insistantes, et les violences physiques et psychologiques qu'elles ont subies ou dont elles ont été témoins.