Fondateur en 1976 du Chicago's Steppenwolf Theater, John Malkovich effectue ses premiers pas de comédien sur les planches à la fin des années 70, et signe la mise en scène de plusieurs spectacles de la troupe. Après avoir joué dans quelques téléfilms, l'acteur américain apparaît sur grand écran sous les traits d'un photographe de presse dans La Dechirure de Roland Joffé en 1984, où son jeu intense marque déjà les esprits. La même année, il glane une nomination à l'Oscar du Meilleur second rôle masculin pour Les Saisons du coeur de Robert Benton. Trois ans plus tard, il se fait à nouveau remarquer dans un contexte agité : celui de L' Empire du soleil de Steven Spielberg où il incarne le compagnon de captivité de Christian Bale. En 1988, John Malkovich assure définitivement son statut de star avec son rôle de Valmont dans Les Liaisons dangereuses de Stephen Frears.

Après avoir été la vedette de l'adaptation Des souris et des hommes en 1992, d'après le roman de Steinbeck, le comédien passe au polar avec Jennifer 8 (1992) et Dans la ligne de mire, qui lui vaut une deuxième nomination à l'Oscar du Meilleur second rôle masculin. Il assume son profil atypique de vedette plus internationale qu'américaine en tournant dans Par-delà les nuages de Wim Wenders, ainsi que dans Le Couvent de Manoel de Oliveira. John Malkovich revient au cinéma anglo-saxon en 1996 avec Mary Reilly, qui lui permet d'incarner le célèbre docteur Jekyll et de retrouver la caméra de Stephen Frears, puis Portrait de femme de Jane Campion.

1997 voit le passage de l'acteur à un cinéma plus commercial : Les Ailes de l'enfer, L' Homme au masque de fer (1998), ou encore Les Joueurs (1998) en sont les témoins. Héros malgré lui du délirant Dans la peau de John Malkovich, il navigue sans cesse entre l'Europe et les Etats-Unis, entre le cinéma d'auteur et le divertissement grand public, se forgeant ainsi une image insaisissable. Coté Vieux Continent, Malkovich ne chôme pas: il participe au Temps retrouvé de Raoul Ruiz, apparaît dans Jeanne d'Arc de Luc Besson, avant de retrouver Paoul Ruiz dans dans Ames fortes. Il participe même au téléfilm français Les Misérables, confirmant son attachement à l'Hexagone. Côté américain, il est impressionnant en Friedrich-Wilhelm Murnau dans L'Ombre du vampire.

En 2002, John Malkovich passe derrière la caméra pour The Dancer upstairs, puis une deuxième fois pour Hideous man (2002), un court-métrage où il est à la fois acteur, scénariste et réalisateur. Ces premières expériences dans la réalisation sont un tournant dans la carrière du comédien, qui décide de s'investir davantage dans les films qui lui tiennent à coeur tel Rochester, le dernier des libertins (2005) dont il est l'un des producteurs et acteurs principaux. Quelques années plus tard, il renoue avec la production avec le cultissime Juno de Jason Reitman. Inégalable dans sa façon d'interpréter les rôles de "méchants" au cinéma, John Malkovich apparaît au casting du film fantastique Eragon. Il retrouve ensuite pour la troisième fois Raoul Ruiz, qui lui offre le rôle de Gustav Klimt dans son film éponyme, personnage tourmenté qui confirme les grandes capacités artistiques de l'acteur.

Après quatre rôles aussi divers qu’intéressants dans L'Echange (2008), Burn After Reading (id.), Et après (2009) et Disgrace (2010), John Malkovich multiplie les prestations dans des divertissements plus grand public : il rejoint le casting impressionnant de Red (et donc de sa suite trois ans plus tard), puis apparaît dans Jonah Hex et le très lucratif Transformers 3. L’acteur n’hésite cependant pas à changer de registre - comme à son habitude - et revenir vers un cinéma "plus d'auteur" (Les Lignes de Wellington), tout en continuant ses activités de producteur, notamment avec la très pertinente comédie dramatique Young Adult portée par Charlize Theron. En 2013, on retrouve Malkovich en père d’une jeune femme éprise d’un zombie dans Warm Bodies de Jonathan Levine.