Né dans le Queens d'un père professeur et d'une mère clown, le frère aîné de l'actrice Hallie Kate Eisenberg commence sa carrière dès l'âge de 13 ans sur les planches de Broadway. Trois ans plus tard, il décroche un rôle dans la série La Famille Green avec Anne Hathaway, dont il joue le frère, mais l'aventure cesse dès la fin de la première saison.

Alors qu'il est accepté à la prestigieuse New York University, Jesse Eisenberg préfère mettre de côté ses études pour incarner l'un des personnages principaux de Roger Dodger. Bonne pioche pour l'acteur car son rôle du neveu de Campbell Scott dans ce film remarqué au Festival de Venise révèle son talent à toute la profession. Il campe par la suite des seconds rôles dans Le Club des empereurs (2002), le terrifiant Village (2004) de M. Night Shyamalan, le flop Cursed (2005) de Wes Craven ou encore le drame familial Les Berkman se séparent (2006) de Noah Baumbach.

Cependant, c'est en 2009 que le jeune acteur crève l'écran. Tout d'abord avec le premier rôle d'Adventureland, où il obtient un job d'été dans un petit parc d'attractions perdu aux côtés de Kristen Stewart, puis surtout dans Bienvenue à Zombieland, où en compagnie de Woody Harrelson, il tente de survivre dans un monde infesté de morts-vivants. Cette comédie horrifique est un tel succès qu'il reprend son rôle dans la suite, Retour à Zombieland, dix ans plus tard.

En 2010, il est le héros de David Fincher dans The Social Network, incarnant l'inventeur de Facebook, Mark Zuckerberg. Pour ce rôle, il est nommé dans de nombreuses cérémonies dans la catégorie Meilleur Acteur, notamment aux Oscars et aux Golden Globes.

On le croise également dans des productions plus modestes, comme Jewish Connection, où il joue un Juif orthodoxe dealer d'ecstasy, et la comédie 30 minutes maximum qui lui permet de retrouver Ruben Fleischer. Après s'être essayé au doublage avec le film d'animation Rio, il tourne en 2012 sous la direction de Woody Allen dans To Rome With Love, entouré d'un casting quatre étoiles (Alec Baldwin, Roberto Benigni, Penélope Cruz et Elliot Page).

La trentaine, l'étoile montante du cinéma américain continue de se démarquer en faisant de grands écarts entre des films commerciaux et/ou grand public (Insaisissables, American Ultra) et des productions indépendantes qui lui permettent de tourner avec des cinéastes reconnus, comme Kelly Reichardt (Night Moves) et Joachim Trier (Back Home).

En 2016, il est à l'affiche de deux films aux antipodes l'un de l'autre : le frivole Café Society de Woody Allen, qui embarque le spectateur dans le New York des années 30, et Batman v Superman: L'aube de la justice, blockbuster DC Comics pour lequel il se rase le crâne, campant l'antagoniste Lex Luthor. Il reprend aussi du service au sein de la bande de magiciens de la lucrative suite d'Insaisissables.

Sans doute douché par l'accueil plus que mitigé réservé au film de super-héros de Zack Snyder, Jesse Eisenberg retourne à partir de la fin des années 2010 à ses premières amours avec le cinéma indépendant. Il participe ainsi à des œuvres plus singulières, comme la comédie noire et absurde The Art Of Self-Defense, qui épingle l'hypermasculinité ; Vivarium (2019), sorte d'épisode de La Quatrième Dimension sur le cauchemar banlieusard d'un couple piégé dans un quartier résidentiel ; et Primitifs (2023), long-métrage dépourvu de dialogues où le comédien, méconnaissable sous son costume, joue le père d'une famille de bigfoot.

Il se tourne aussi vers la télévision et est au générique en 2022 de la mini-série Anatomie d'un divorce, saluée par la critique et nommée à sept reprises aux Emmy Awards.

En 2024 sort son deuxième long-métrage en tant que réalisateur, A Real Pain. Si son premier film, When You Finish Saving the World, passe relativement inaperçu malgré la présence de Julianne Moore et sa sélection à la Semaine Internationale de la Critique au Festival de Cannes 2022, A Real Pain l'impose comme un réalisateur et scénariste de talent. Ce périple en Pologne de deux cousins partis sur les traces de leur grand-mère, rescapée de la Shoah, lui vaut d'être nommé à l'Oscar du meilleur scénario original. Présent également devant la caméra, Jesse Eisenberg donne la réplique à Kieran Culkin, qui reçoit quant à lui l'Oscar du meilleur acteur dans un second rôle.