Samuel L. Jackson entre au Morehouse College d'Atlanta pour entreprendre des études d'architecture mais c'est avec un diplôme d'art dramatique qu'il en ressort en 1972. Il fait ses débuts au cinéma la même année dans Together for days de Michael Schultz, mais préfère d'abord se consacrer au théâtre en jouant sur les planches new-yorkaises.

C'est à New York que Samuel L. Jackson fait la rencontre de Spike Lee, qui lui confiera plus tard quelques petits rôles dans ses films (Do the right thing, Mo' Better Blues). Après des apparitions dans Un prince à New York et Les Affranchis, c'est cette collaboration qui lui permet d'obtenir au Festival de Cannes 1991 le Prix du Meilleur second rôle pour Jungle Fever, dans lequel il incarne un junkie. Mais c'est son rôle de Jules, le tueur philosophe du Pulp Fiction de Quentin Tarantino (1994), qui le propulse au rang de star. Tarantino le dirigera à nouveau dans Jackie Brown, en 1998, et lui offrira également un petit rôle dans Kill Bill : volume 2, en 2004 et Inglourious Basterds en 2010.

Particulièrement prolifique dans les années 90, Samuel L. Jackson se distingue notamment par ses rôles de policier, comme dans Kiss of death (Barbet Schroeder, 1994) ou Négociateur (F. Gary Gray, 1998). En 2000, il incarne le célèbre flic noir Shaft. Très à l'aise dans les films grand public, il joue ainsi dans Jurassic Park et a pour partenaire Bruce Willis dans Une journée en enfer (1995), acteur avec qui il collaborera à nouveau dans Incassable (M. Night Shyamalan, 2000). Ce dernier film démontre que l'acteur, fer de lance d'un cinéma dit commercial, sait aussi se tourner vers des projets plus ambitieux, comme lorsqu'il incarne un père vengeur dans Le Droit de tuer ?.

Figure hollywoodienne incontournable, Samuel L. Jackson est choisi par George Lucas pour être Mace Windu dans les trois premiers volets de la saga Star Wars, en 1999 (La Menace fantôme), 2002 (L'Attaque des clones) et 2005 (La Revanche des Sith). Toujours aussi actif dans les années 2000, il apparaît notamment aux génériques d'XXX et sa suite, de S.W.A.T. unité d'élite, de Basic, de Coach Carter, de Black Snake Moan et du très fun Des serpents dans l'avion, où il confirme son aptitude à ne pas se prendre au sérieux. En 2008, l'acteur s'illustre dans les thrillers fantastiques Chambre 1408 et Jumper, ainsi que dans le film de super-héros Iron Man, aux côtés de Robert Downey Jr.

Après avoir prêté sa voix au film Astro Boy puis à la série Afro Samuraï, il fait équipe avec Dwayne Johnson pour les besoins de la comédie policière Very Bad Cops. Son agenda est particulièrement chargé puisqu’il apparaît dans Captain America de Joe Johnston et Avengers de Joss Whedon dans le rôle de l'agent du SHIELD Nick Fury.

Très sollicité, l'acteur croule sous les propositions, et pas des moindres : les productions à gros budget sont sa spécialité. En 2013, Il retrouve son complice Tarantino pour l’excellent Django Unchained, western spaghetti à la sauce "tarantinesque" où il apparaît, vieilli, sous les traits de Stephen, le fidèle et impitoyable valet de Calvin J. Candie (Leonardo DiCaprio). Il est également à l’affiche des remakes de Oldboy et RoboCop, reprend plus tard le rôle de Nick Fury dans Captain America : Le Soldat de l’hiver et rejoint Colin Firth et le jeune Taron Egerton dans Kingsman : services secrets, adaptation du comics du même nom, signée Matthew Vaughn.

Parallèlement à la franchise du MCU dans laquelle il reprend à plusieurs reprises son personnage de Nick Fury (L'Ere d'Ultron, Infinity War, Captain Marvel, Endgame, Spider-Man: Far From Home), Samuel L. Jackson privilégie les blockbusters comme en témoignent ses prestations dans Tarzan, Kong: Skull Island, Hitman & Bodyguard et sa suite. Il refait aussi une fois de plus équipe avec Tarantino pour le violent western en huis clos Les Huit salopards et se glisse à nouveau dans la peau du maléfique Elijah Price dans Glass, suite d'Incassable et Split.

Au début des années 2020, on peut le voir, entre autres, dans le très gore Spirale : L'Héritage de Saw et le film d'action The Protégé de Martin Campbell.