Après avoir manifesté son intention de devenir peintre, dessinateur ou mécanicien, Samuel Le Bihan se lance dans la voie de la comédie en fréquentant le Cours Florent et en faisant l'expérience du théâtre de rue qui l'emmène sur les routes d'Europe. Il intègre également le Conservatoire ainsi que la Comédie Française où il réside de 1995 à 1997. C'est le cinéaste René Féret qui lui offre ses premiers rôles intéressants dans Promenades d'été (1992) et La Place d'un autre (1993). Sa carrière lancée, on le voit tourner sous la direction de grands noms de la réalisation : Krzysztof Kieslowski (Trois couleurs - Rouge, 1994), Régis Wargnier (Une femme française, 1995) ou Alain Corneau (Le Cousin, 1997).

Également au générique d'A vendre (1998) de Laetitia Masson, il est nommé au César du Meilleur espoir masculin pour sa performance dans Capitaine Conan (1996) de Bertrand Tavernier. Nouvelle gueule d'amour du cinéma français, à laquelle Nathalie Baye n'est d'ailleurs pas insensible dans Vénus beauté (institut) (1999), Samuel Le Bihan connaît véritablement la consécration en 2000 grâce au succès de la comédie Jet Set de Fabien Onteniente - un metteur en scène avec qui il collaborera à nouveau pour 3 zéros (2002) et Disco (2008) - et du film fantastique Le Pacte des loups de Christophe Gans.

Incarnation de l'amant parfait (A la folie, pas du tout, 2002) ou de la virilité à l'état brut (Une affaire privée, La Mentale, Fureur), l'acteur tente une carrière à l'international (Le Pont du roi Saint-Louis, Le Dernier signe, 2005), de producteur (Exes, 2006) et de réalisateur (Saison 1 de la série Sable noir, id.). Prêtant sa voix au vétéran du circuit Chick Hicks dans le film d'animation Cars (2006) de John Lasseter, il effectue un retour remarqué à l'écran en s'essayant au registre horrifique (Frontière(s), 2007) et en se trémoussant sur des airs de Disco (2008). La même année, il n'hésite pas à prendre 20 kilos pour camper Michel Ardouin, l'un des complices de Mesrine dans L'Instinct de mort, et dans sa suite.

Après avoir tourné dans des téléfilms en 2010 (Obsession(s) et Le Piège Afghan), il se retrouve parmi les acteurs récurrents de la série policière Braquo. Il débute ensuite l'année 2012 avec un film qui s'inscrit dans le même genre : Une nuit. Il y donne la réplique à Roschdy Zem. La même année, l'acteur porte l'un des principaux rôles du mystérieux Cornouaille de Anne Le Ny. Il campe ensuite l'inspecteur Brennan dans le thriller Voyage sans retour et le mari alcoolique dans Les Yeux jaunes des crocodiles. Il faut ensuite attendre 2023 pour le retrouver sur grand écran : dans la comédie Ma langue au chat et surtout dans l'horrifique Gueules noires, où il joue un mineur confronté à une étrange force maléfique.

Parallèlement, Samuel Le Bihan privilégie la télévision. En témoignent ses prestations dans les téléfilms Le Général du roi, La Dernière échappée, La Femme aux cheveux rouges, Les Ombres du passé et T'en fais pas, j'suis là. Le comédien incarne aussi le personnage principal de la mini-série thriller Ils étaient dix et de la série policière Alex Hugo. Dans cette dernière, il joue un ancien grand flic marseillais ayant choisi de s'isoler dans la montagne. La découverte d'un cadavre l'amène à reprendre du service.