Fils d'un décorateur de plateau, Dustin Hoffman étudie l'art dramatique à la Pasadena Community Playhouse, puis part à New York suivre les cours du célèbre Lee Strasberg, à l'Actor's Studio. En 1964, il fait ses débuts sur les planches, dans une pièce de Samuel Beckett, En attendant Godot.

Alors qu'il joue Eh ? à Broadway, Mike Nichols le remarque et lui offre le rôle principal du Laureat (1967), qui lui vaut une nomination à l'Oscar du meilleur acteur. Le succès qu'il remporte alors lui permet de profiter des fastes années 70 du cinéma américain, et, variant les registres, de multiplier les tournages de films dont la plupart sont depuis devenus des classiques du 7ème art. Il incarne ainsi l'escroc Ratso Rizzo dans Macadam cowboy (1969), joue dans Little Big Man (1970), les Chiens de paille (1971) de Sam Peckinpah, Papillon (1973), aux côtés de Steve McQueen, Lenny de Bob Fosse (1974)... Peu après, il se glisse dans la peau du journaliste du Washington Post Carl Bernstein dans Les Hommes du president d'Alan J. Pakula, avant de subir un véritable calvaire entre les mains du dentiste tortionnaire Laurence Olivier, dans le glaçant Marathon man (1976). En 1979, le film de Robert Benton, Kramer contre Kramer (1979), lui rapporte son premier Oscar de meilleur acteur.

Travesti en femme pour interpréter le comédien au chômage de Tootsie (1982), l'acteur émeut en autiste prodige chaperonné par Tom Cruise, dans Rain Man (1988). Deux grands succès, qui lui valent une nouvelle nomination à la statuette du meilleur acteur (Tootsie) puis un deuxième Oscar pour "Rain Man" en 1989. On retrouve dès lors Dustin Hoffman, toujours irréprochable, dans des films moins marquants, comme Hook ou la revanche du Capitaine Crochet de Steven Spielberg (1990), ou Alerte de Wolfgang Petersen (1995), même s'il s'illustre en 1992 dans le satirique Héros malgré lui de Stephen Frears. Retour à un ton polémique en 1997 avec Mad City de Costa-Gavras, et Des hommes d'influence de Barry Levinson, dans lequel l'acteur incarne un cynique producteur hollywoodien. En 1999, l'acteur endosse la soutane pour le Jeanne d'Arc de Luc Besson, se faisant ensuite plus discret durant quelque temps, avant un retour amorcé en 2003.

Enchaînant les tournages à un rythme de plus en plus soutenu, parfois pour de simples apparitions (Les Désastreuses aventures des orphelins Baudelaire), il campe un directeur de théâtre pince-sans-rire et débonnaire dans Neverland, avant de retrouver la même année Robert De Niro à l'affiche d'une pure comédie, Mon beau-père, mes parents et moi, et de s'adjoindre à l'impressionnant casting du quatrième film de David O. Russell, J'adore Huckabees. En 2006, il joue dans Le Parfum : histoire d'un meurtrier de Tom Tykwer avant de s'afficher dans L'Incroyable destin de Harold Crick de Marc Forster. Particulièrement fier du film, il collabore à nouveau avec son scénariste, Zach Helm, pour son premier film, la comédie fantastique Le Merveilleux magasin de Mr Magorium. En 2009, il est de retour dans une comédie romantique, partageant l'affiche avec Emma Thompson dans Last Chance for Love, et en prêtant sa voix au rat marginal Roscuro dans le film d'animation La Légende de Despereaux.

En 2010 et 2011, il officie dans des rôles de père, interprétant une nouvelle fois le paternel de Ben Stiller dans Mon beau-père et nous, puis celui de Paul Giamatti dans le mélancolique Monde de Barney. Parallèlement, l'acteur donne de la voix pour Kung Fu Panda et sa suite, et porte la série Luck (qu'il produit également), malheureusement annulée au bout d'une saison en raison de la mort de trois chevaux pendant son tournage. Toujours en forme, on le voit ensuite passer derrière la caméra - à l'âge de 75 ans - avec Quartet, une comédie anglaise pleine d'espoir emmenée par Maggie Smith, Tom Courtenay, Billy Connolly, Pauline Collins et Michael Gambon. On le voit ensuite, souvent en second rôle, dans le culinaire #Chef, la comédie fantastique The Cobbler, le drame Le Virtuose, le biopic The Program, l'horrifique L'Homme du labyrinthe, la comédie dramatique Sam & Kate, la fresque SF Megalopolis de Francis Ford Coppola et le polar Diamond de Andy Garcia.