Sergio Castellitto débute sa carrière sur les planches, notamment dans les pièces Mesure pour mesure et Le Marchand de Venise de William Shakespeare. Travaillant très tôt des deux côtés des Alpes, il se révèle sur grand écran en 1983 dans Le General de l'armee morte de Luciano Tovoli.

Voleur pour Arthur Joffe dans Alberto Express, confident d'Isabelle Adjani dans Toxic Affair ou encore détective paumé dans A vendre, il séduit les réalisateurs français. Luc Besson l'engage pour Le Grand Bleu, Valérie Lemercier pour Quadrille, alors que Jacques Rivette lui confie le rôle d'un metteur en scène italien dans Va savoir.

En 1999, Sergio Castellito se lance dans la réalisation avec Libero Burro, où il donne la réplique à Michel Piccoli et Chiara Mastroianni. Malgré cette nouvelle fonction, ce Romain d'origine reste fidèle aux productions de son pays natal et s'illustre dans Concurrence déloyale, Juste un baiser ou Le Sourire de ma mère. Vedette de Chère Martha en 2003, il retrouve Arthur Joffe un an plus tard pour Ne quittez pas ! et revient à la mise en scène avec le drame A corps perdus, où il donne la réplique à Penélope Cruz.

En 2006, il retrouve Luc Besson, mais cette fois, pour prêter sa voix au chef de gare du film d'animation Arthur et les Minimoys. L'année suivante, il incarne le commercial d'une grande firme italienne qui décide d'aller en Chine, dans le nouveau film de Gianni Amelio, L'Etoile imaginaire. De retour, de son périple cinématographique Sergio Castellitto tient le rôle de Mario dans Comme il faut, le second film de Sandra Nettelbeck. L'acteur international enchaîne les rôles en 2007, puisqu'il tourne aux côtés d'Emmanuelle Seigner dans Laguna de Dennis Berry et retrouve son pays natal dans Il Regista di matrimoni de Marco Bellocchio.