Fille du dramaturge Victor Haïm, Mathilda May suit d'abord la voie tracée par sa mère, professeur de danse. Elle pratique cette activité dès l'âge de 8 ans, jusqu'à obtenir en 1983 le Premier Prix du Conservatoire National de Paris. Repérée par l'agent Myriam Bru, elle s'oriente alors vers la comédie, décrochant son premier rôle, celui d'une princesse, dans Nemo (1984), adaptation de la BD de Winsor McCay.

Apparue peu après Valérie Kaprisky et peu avant Béatrice Dalle, Mathilda May s'impose bientôt comme l'un des grands sex-symbols français des années 80. D'abord employée dans des comédies (Les Rois du gag), elle s'aventure dans des univers plus troubles grâce à Claude Chabrol, qui en fait l'héroïne du Cri du hibou, une prestation saluée par un César du Meilleur espoir en 1988. Lauréate l'année suivante du Prix Romy-Schneider, elle emprunte La Passerelle face à Arditi, puis chante et danse aux côtés de Montand dans Trois places pour le 26 de Demy.

Après Chabrol et Demy, c'est encore un quasi-vétéran, Michel Deville, qui la choisit pour incarner l'objet du désir dans l'obscur Toutes peines confondues (1992). Bigas Luna n'est pas insensible aux appas de la pulpeuse Mathilda May (La Lune et le Téton, avec Gérard Darmon, alors compagnon de l'actrice), qui enchaîne les projets atypiques, tournés en Algérie (Isabelle Eberhardt) ou en Patagonie (Le Cri de la roche de Herzog) et prête sa voix à Pocahontas dans la vf du fameux Disney (1995). Partenaire de Bruce Willis dans Le Chacal en 1997, elle est alors peu sollicitée par les cinéastes français, et se tiendra éloignée des plateaux pendant plusieurs années. Mais Claude Chabrol ne l'a pas oubliée, qui lui confie un rôle dans La Fille coupée en deux (2007), 20 ans après Le Cri du hibou.