Fils d'un immigré italien, Fabrice Luchini grandit dans le quartier parisien de la Goutte d'or où, dès son plus jeune âge, il vend à la criée les fruits et légumes du commerce de ses parents. Préférant la rue à l'école, il se passionne néanmoins très tôt pour la littérature en dévorant Balzac, Flaubert ou Proust, goût qu'il cultivera d'ailleurs toujours en autodidacte. A 13 ans, sa mère le place dans un salon chic de l'avenue Matignon comme apprenti coiffeur, mais sa passion pour la soul music en fait un habitué des discothèques, où il est repéré par Philippe Labro, qui lui confie son premier rôle dans Tout peut arriver (1969).

Fabrice Luchini joue ensuite dans Le Genou de Claire d'Eric Rohmer, dont il va devenir l'acteur fétiche, et s'inscrit parallèlement aux cours de Jean-Laurent Cochet. Comme une révélation, il y découvre le théâtre, "seul lieu où s'exprime la vie, la nourriture de la vie, ce qu'aucune école n'enseignera jamais". Fort de cette nouvelle expérience, il retrouve Rohmer pour le très audacieux Perceval le Gallois (d'après l’œuvre de Chrétien de Troyes) puis pour Les Nuits de la pleine lune en 1984. Passant du cinéma pointu d'Oshima ou de Pierre Zucca à P.R.O.F.S. et à Emmanuelle 4, Luchini voit sa notoriété dépasser le cercle des cinéphiles grâce à La Discrète de Christian Vincent (1990) dans lequel il impose son personnage de dandy précieux à l'éloquence ciselée.

Fabrice Luchini est alors de plus en plus sollicité, laissant libre cours à sa verve et à sa fantaisie teintée d'inquiétude dans Riens du tout (le premier Klapisch en 1992), Tout ça... pour ça ! de Lelouch (1993), ou encore Beaumarchais, l'insolent d'Edouard Molinaro (1995). Devenu un acteur de premier plan, il donne la réplique à des actrices telles que Sandrine Kiberlain (Rien sur Robert, 1999), Nathalie Baye (Barnie et ses petites contrariétés, 2001) Géraldine Pailhas (Le Coût de la vie, 2002) ou Sandrine Bonnaire (Confidences trop intimes, 2004).

Acteur populaire, bon client dans les médias, Fabrice Luchini forme un tandem inattendu avec Johnny Hallyday dans le loufoque Jean-Philippe de Laurent Tuel (2006). Il se délecte ensuite à jouer les M. Jourdain dans le Molière de Laurent Tirard (2007), ce qui n'étonne guère de la part d'un comédien qui revient régulièrement sur les planches, où il se fait l'humble passeur des textes de La Fontaine, Céline ou Barthes. Lui qui se plaît à jouer seul en scène accepte volontiers de faire partie des castings pléthoriques de films choraux tels que Paris ou Musée haut, musée bas (2008). Avec La Fille de Monaco, Luchini côtoie Roschdy Zem et l'ex-miss météo de Canal+ fraîchement actrice, Louise Bourgoin, pour sa première collaboration avec Anne Fontaine, avant de rejoindre Anne Le Ny pour sa seconde réalisation, Les Invités de mon père.

L'année suivante lui offre l'opportunité de travailler pour la première fois avec François Ozon dans le déluré Potiche, sélectionné à Venise en Compétition officielle, et dans lequel il rejoint un casting prestigieux (Gérard Depardieu, Catherine Deneuve, Karin Viard). De plus en plus apprécié du grand public, Luchini est ensuite à l'affiche du succès surprise de 2011, Les Femmes du 6e étage : il y joue un bourgeois engoncé dans son quotidien étriqué qui trouve l'épanouissement auprès des très folkloriques domestiques espagnoles du 6ème étage, délaissant par la même occasion sa femme, interprétée par Sandrine Kiberlain.

Fort de sa première collaboration avec Ozon, il réitère l'expérience en 2012 avec le thriller intimiste Dans la maison. Il renoue pour l'occasion avec son amour des belles lettres puisqu'il y campe un professeur de français. Ce rôle sérieux n'empêche pas pour autant le comédien de se livrer à des expériences plus légères, en intégrant le casting d'Astérix et Obélix: Au service de sa Majesté, comédie gauloise par excellence dans laquelle il succède à Alain Delon sous les traits de l'Empereur Jules César.

Privilégiant les films aux dialogues riches, Fabrice donne la réplique à Lambert Wilson dans Alceste à bicyclette (2013), Gemma Arterton dans Gemma Bovery (2014) et tourne même sous la direction de sa fille dans Un début prometteur (id.). Dans L'Hermine de Christian Vincent, l'acteur campe un Président de cour d'assises redouté et chevronné. Parallèlement au théâtre où il est très actif, il prend part à l'original Ma loute de Bruno Dumont (avec qui il refait équipe dans Jeanne en 2019, où il joue Roi Charles VII) et se glisse dans la peau d'un homme d’affaires brillant victime d'un accident cérébral dans Un homme pressé.

En 2019, Fabrice Luchini incarne le maire de Lyon dans la comédie dramatique et politique Alice et le maire, et mène la même année l'enquête aux côtés de Camille Cottin dans Le Mystère Henri Pick. Trois ans plus tard, il est au coeur d'un documentaire consacré à lui-même et à Isabelle Huppert (Par coeurs de Benoit Jacquot) puis incarne à nouveau un maire (conservateur cette fois) dont la femme de très longue date, Catherine Frot, lui annonce qu'elle a toujours été un homme, dans Un homme heureux.