Après être sortie diplômée de l'École nationale supérieure des arts et techniques du théâtre de Lyon en 2000, Audrey Fleurot joue dans de nombreuses pièces de théâtre et apparaît aussi à la télévision, notamment dans l'un des épisodes de la série Blague à part. Mais c'est grâce au succès de Kaamelott, où elle campe la Dame du Lac tout au long des 6 saisons, qu'elle se fait remarquer. Toujours à la télévision, elle s'illustre dans un autre registre à partir de 2005 dans le rôle d'une avocate dans la série Engrenages.

Au cinéma, elle débute avec des petits rôles dans Les Deux mondes en 2007 puis 4 ans plus tard dans Les Femmes du 6e étage (2011) de Philippe Le Guay. Cette même année, elle s'affiche dans Minuit à Paris de Woody Allen mais sa performance est coupée au montage. C'est avec Intouchables d'Eric Toledano et Olivier Nakache qu'Audrey Fleurot trouve un rôle marquant au cinéma, aux côtés d'Omar Sy et François Cluzet. L'actrice enchaîne avec La Délicatesse, comédie romantique portée par le duo Tautou/Damiens et dans laquelle elle incarne la secrétaire de Bruno Todeschini.

Tout en continuant à apparaître régulièrement à la télévision, notamment dans la série historique Un Village français, l'actrice enchaîne les comédies sur grand écran. Elle est tour à tour une présidente des Etats-Unis un brin décalée dans Mais qui a re-tué Pamela Rose ? (2012) de et avec Kad Merad et Olivier Baroux, une professeure stricte mais qui cache un drôle de secret dans La Vraie vie des profs (2013), une caissière qui s'essaie au catch dans Les Reines du ring (id.), une célibataire fêtarde dans Les Gazelles (2014), un esprit condamné à hanter un château dans Le Fantôme de Canterville (2016) et la directrice visuelle autoritaire d'une entreprise de cosmétiques dans L'Idéal (id.). 

Toujours aussi courtisée par la télévision, elle s'amuse avec son image en jouant son propre rôle dans un épisode de la saison 1 de Dix pour cent en 2015. Elle retrouve France 2 deux ans plus tard pour la saison 2 des Témoins dans laquelle elle est une femme amnésique dont les anciens amants sont assassinés. Elle poursuit en 2018 dans la veine du thriller avec Safe de l'auteur à succès Harlan Coben aux côtés de Michael C. Hall. Six ans après Mais qui a re-tué Pamela Rose ?, Audrey Fleurot incarne à nouveau une Chef d'État mais dans un registre plus sérieux et tendre. Dans le choral La Fête des mères, elle est la Présidente de la République qui tente de jongler entre sa fonction et son rôle de mère.

En 2019, l'actrice campe l'une des trois héroïnes de la série historique inspirée de l'incendie qui a ébranlé Paris en 1897, Le Bazar de la Charité. Deux ans plus tard, elle joue une mère de famille au QI exceptionnel qui devient consultante pour la police aux côtés de Mehdi Nebbou, dans un autre programme TF1, HPI. La chaîne lui confie également, en 2021, le rôle principal féminin de Mensonges. Dans cette adaptation de la série britannique Liar, elle prête ses traits à Jeanne Sarlat, un professeur accusant le père d'un de ses élèves de l'avoir violée.

Très active en parallèle d'HPI, Audrey trouve de solides rôles dans d'autres séries comme Les Combattantes et Infiltré(e). N'en oubliant pas le cinéma, la comédienne joue dans les comédies À cause des filles..?, Divorce Club, Connectés, Kaamelott : Premier Volet, Haters et La Très Très Grande Classe. En 2025, elle s'attaque à un registre un peu moins joyeux avec Regarde, aux côtés de Dany Boon.