Fils du réalisateur Peter Kassovitz (Droles d'oiseaux !, 1993, Jakob le menteur, 1999), Mathieu Kassovitz fait ses débuts à l'écran dans l'un des films de son père, Au bout du bout du banc (1978). Il apparaît la même année dans L'Année prochaine... Si tout va bien, aux côtés d'Isabelle Adjani.

Il fait ses débuts de réalisateur avec le court métrage Fierrot le pou (1990), qui sera suivi de deux autres courts puis de son premier long en 1993, Metisse, dans lequel il interprète également l'un des rôles principaux. Par la suite, il continue de faire l'acteur, dans la série des 3000 scénarios contre un virus (dans le court métrage Avant... mais apres de Tonie Marshall) ou dans Regarde les hommes tomber (1994), de Jacques Audiard, aux côtés de Jean-Louis Trintignant et Jean Yanne. Il retrouvera le metteur en scène deux ans plus tard pour Un héros très discret. Entre temps, il aura créé l'événement avec La Haine (1995), qui remporte le Prix de la mise en scène à Cannes et lui rapporte trois César, dont celui du Meilleur film.

Jodie Foster elle-même soutient le film lors de sa sortie américaine. Pamphlet qui dénonce les bavures policières, le film est très mal reçu par les forces de l'ordre et génère une controverse. La Haine sera suivi en 1997 par une réalisation elle aussi polémique, Assassin(s), où, apprenti tueur, il donne la réplique à Michel Serrault. Le film, présenté à Cannes, est un échec public et critique. La même année, il fait une apparition dans Le Cinquième élément, de Luc Besson. On le retrouve en 2000 comme réalisateur avec Les Rivières Pourpres, qui réunit Jean Reno et Vincent Cassel, et comme acteur chez Jean-Pierre Jeunet dans Le Fabuleux destin d'Amélie Poulain. En 2002, il est à l'affiche de Nadia aux côtés de Nicole Kidman et tient la vedette d'Amen. de Costa-Gavras.

En 2003, contacté par le producteur Joel Silver (la saga Matrix), Mathieu Kassovitz fait ses grands débuts américains sous l'égide de la société Dark Castle avec le thriller Gothika dans lequel il dirige Halle Berry et Penélope Cruz. Après avoir déclaré qu'il s'était retiré du métier d'acteur pour se consacrer plus particulièrement à son travail de metteur en scène, et, qu'il faudrait au moins Steven Spielberg, pour lui donner envie d'être à nouveau de l'autre côté de la caméra, il tourne en 2005 dans Munich sous la direction de son cinéaste fétiche. Kassovitz y interprète un agent du Mossad. Il fait également de courtes apparitions dans Avida (2005) ou Louise-Michel (2008), et produit quelques films pour d'autres comme Nèg Maron (2004) de Jean-Claude Flamand Barny et Johnny Mad Dog (2007) de Jean-Stéphane Sauvaire.

Il développe ensuite un projet de science-fiction qui lui tient particulièrement à cœur, adapté de l'oeuvre de Maurice G. Dantec. Babylon A. D., sorti en 2008, réunit un casting international composé de Mélanie Thierry, Michelle Yeoh, Lambert Wilson, Charlotte Rampling, Mark Strong, Gérard Depardieu et enfin Vin Diesel dans le rôle principal. Mais la relation entre ce dernier et le réalisateur, à l'instar du tournage, tourne au vinaigre. Cette production chaotique fait même l'objet d'un making-of intitulé Fucking Kassovitz. Considéré comme un échec commercial et artistique, Babylon A.D. reste un mauvais souvenir pour Mathieu Kassovitz.

Il revient en 2011 avec le doublage d'une oeuvre d'animation, The Prodigies, et une nouvelle réalisation, L'Ordre et la morale, dont il est aussi l'interprète principal. Ce drame historique relate les tragiques événements survenus sur une île de la Nouvelle Calédonie en 1988 et renoue avec le cinéma politique et engagé de ses débuts. 

Depuis, c'est en tant qu'acteur qu'il poursuit sa carrière, dans des registres aussi divers que le film en costumes (le remake d'Angélique), la romance (La Vie d'une autre, De plus belle), le thriller (Un illustre inconnu, Le Chant du loup) et la comédie (Tout simplement noir, Les Méchants). Il tourne sous la direction de cinéastes reconnus, de Steven Soderbergh (Piégée) à Cédric Kahn (Vie sauvage), en passant par Michele Placido (Le Guetteur) et Michael Haneke (Happy End). Il est également le narrateur de la série Apocalypse, qui regroupe plusieurs docu-fictions consacrés aux deux guerres mondiales.

De 2015 à 2020, il incarne le personnage principal de la série d'espionnage à succès Le Bureau des légendes créée par Eric Rochant (il réalise également six épisodes de ce programme Canal+). En 2018, Mathieu Kassovitz livre l'une de ses prestations les plus impressionnantes dans Sparring, un drame dans lequel il incarne un boxeur vieillissant qui devient le sparring-partner d’un champion. Un rôle taillé sur-mesure pour le comédien qui pratique lui-même le noble art à un niveau amateur (il livre son premier combat en juin 2018).

Après avoir tourné sous la direction d'acteurs/réalisateurs — Guillaume Canet (Lui), Yvan Attal (Les Choses humaines) et Nicolas Giraud (L'Astronaute) —, Mathieu Kassovitz est à l'affiche en 2023 de Visions, un thriller paranoïaque par le réalisateur de Boîte noire. Il y interprète le mari de Diane Kruger, une pilote de ligne qui perd pied avec la réalité. Le 3 septembre 2023, quelques jours avant la sortie de ce long-métrage, il est victime d'un accident de moto alors qu'il conduit sur le circuit automobile de Linas-Montlhéry, en Essonne, lors d’un stage de perfectionnement de conduite pour les besoins d’un tournage. Si son pronostic vital n'est pas engagé, le comédien et réalisateur est grièvement blessé et placé en coma artificiel. Le 6 septembre, il fait savoir via ses réseaux sociaux qu'il est en rééducation après plusieurs opérations.