Petite-fille de Louis Seigner, nièce de Francoise et soeur d'Emmanuelle Seigner.

Enfant de la balle, Mathilde Seigner étudie la comédie au cours Florent, avant de faire sa première apparition au cinéma en 1994, aux côtés de sa soeur Emmanuelle, dans Le Sourire de Claude Miller. Elle trouve un premier grand rôle dans Rosine de Christine Carrière, âpre chronique en milieu ouvrier : son émouvante composition de jeune mère d'une adolescente lui vaut le prix Michel-Simon en 1995. Deux ans plus tard, la comédienne est nommée au César du Meilleur second rôle féminin pour son rôle de tranformiste dans Nettoyage a sec.

Lauréate du Prix Romy-Schneider en 1999, Mathilde Seigner prend part au succès-surprise de Tonie Marshall, Vénus beauté (institut), dans lequel elle a pour collègues esthéticiennes Audrey Tautou et Nathalie Baye, et incarne la fille de Catherine Deneuve dans Belle Maman. Appréciée pour sa spontanéité et son caractère bien trempé, l'actrice gagne très vite les faveurs des spectateurs, grâce notamment au nostalgique Une hirondelle a fait le printemps (2001), dans lequel elle campe une citadine qui découvre les joies de la campagne.

Mais, refusant les étiquettes, celle qui incarna Madame Sans-Gêne pour la télévision s'illustre également dans le cinéma d'auteur. Seigner fait ainsi partie du quatuor de comédiens qui porte le thriller Harry, un ami qui vous veut du bien, en 2000, et Claude Miller lui confie deux beaux personnages, l'optimiste Odette, hospitalisée dans La Chambre des Magiciennes, et la mère en galère de Betty Fisher et autres histoires. Affectionnant les rôles de composition -star de la météo dans Le Bleu des villes, flic dans Tristan- l'actrice au fort tempérament interprète deux jumelles dans Les Parisiens de Lelouch. Avec Mariages ! puis Tout pour plaire en 2004, deux réflexions amusées sur la vie de couple -signées par des femmes-, elle s'impose comme une des stars de la comédie à la française, ce que viennent encore confirmer, sur un mode plus délirant, Palais royal ! de Valérie Lemercier (2005) et Camping de Fabien Onteniente (2006).

Soucieuse de varier les registres, la comédienne s'adonne ensuite, à trois reprises, au drame. Dans Le Passager de l'été, tout d'abord, où elle tombe sous le charme de Gregori Derangère. Puis dans Zone libre, un film tout en nuances sur l'occupation, et enfin dans Danse avec lui, où elle campe une jeune femme torturée, qui réapprend à vivre après une rupture dramatique. Avec 3 Amis, Mathilde Seigner amorce son retour à la comédie. Dirigée par Michel Boujenah, elle donne la réplique à Kad Merad et Pascal Elbé, trois ans après Tout pour plaire. Actrice populaire et attachante, elle se glisse ensuite dans la peau d'une femme infidèle dans la comédie de moeurs Détrompez-vous.

Après une brève absence sur les écrans, elle revient en 2009 avec trois comédies dramatiques sur la famille : Quelque chose à te dire, dans lequel elle joue une peintre à fort tempérament ; Trésor, où elle incarne une épouse qui rend Alain Chabat fou avec sa passion pour les chiens, et Une semaine sur deux (et la moitié des vacances scolaires), l'opportunité de composer avec Bernard Campan un couple divorcé. Après une première expérience dans la réalisation avec Finies les vacances (2010), la comédienne retourne devant les caméras, dans deux comédies populaires : Camping 2, où elle incarne à nouveau l'épouse mécontente Sophie Gatineau, et le remake La Guerre des boutons (2011), dans lequel elle donne la réplique à Eric Elmosnino, Fred Testot et encore une fois Alain Chabat.

Suite à une incursion, en 2012, dans le sombre thriller Dans la tourmente de Christophe Ruggia avec Clovis Cornillac et Yvan Attal, Seigner reprend la voie du drame cette même année avec Bowling, sur la lutte du personnel hospitalier contre la fermeture d'une maternité, et ensuite Max, un drame sentimental qui met en scène une histoire d'amour avec un jeune père veuf, incarné par le très à la mode Joey Starr. Mathilde change de registre en 2015 avec le rôle poignant de Marie dans Une mère. Elle y campe une femme qui se bat pour rester debout et sortir son fils des mauvais coups dans lesquels il s’enfonce.

L'actrice retourne ensuite dans son genre de prédilection, la comédie, enchaînant Retour chez ma mère, Boule & Bill 2, Coexister et Chacun sa vie de Claude Lelouch. En 2019, Mathilde est à l'affiche de 3 films : le biopic Edmond, revenant sur une partie de la vie de l'auteur Edmond Rostand, Ibiza, dans lequel elle joue la femme de Christian Clavier et Ni une ni deux, où elle interprète des soeurs jumelles aux caractères opposés.