Enfant, Virginie Ledoyen apparaît dans des spots publicitaires, notamment pour les marques Buitoni et Air Inter, et dans le vidéo clip "L'Aziza" de Daniel Balavoine. A dix ans, elle débute au cinéma dans un film italien intitulé Les Exploits d'un jeune Don Juan (1987), mais c'est Philomène Esposito qui lui offre son premier grand rôle en 1991 avec Mima. Après avoir joué dans Mouche, le film inachevé de Marcel Carné, l'adolescente s'illustre dans Les Marmottes (1993) d'Elie Chouraqui, L'Eau froide (1994) d'Olivier Assayas et La Fille seule (1995) de Benoît Jacquot, trois prestations pour lesquelles elle est nommée trois fois au César du Meilleur espoir féminin.

Fille de bonne famille dans La Cérémonie de Claude Chabrol, elle déploie ses charmes en incarnant une chanteuse pop dans Héroïnes (1997), en poussant la chansonnette dans la comédie musicale Jeanne et le garçon formidable (1998) et en envoûtant Gérard Lanvin dans En plein coeur (1998), le remake de En cas de malheur (id.). Devenue ambassadrice pour la marque de cosmétiques L'Oréal en 1999, elle se trouve propulsée au rang de star en donnant la réplique à Leonardo DiCaprio dans le film d'aventure La Plage (2000) de Danny Boyle.

Aussi à l'aise dans le film noir (De l'amour de Jean-Francois Richet) que dans la comédie burlesque (8 femmes de François Ozon), elle côtoie Gérard Depardieu et Isabelle Adjani pour les besoins de Bon voyage (2003) et s'essaye au fantastique dans Saint-Ange (2004). Tentée par une carrière internationale (The Backwoods, Love and Virtue), Virginie Ledoyen reste souvent associée en France à l'image d'une jeune femme romantique comme en témoignent ses prestations dans La Doublure (2006), Un baiser s'il vous plaît (2007) et Mes amis, mes amours (2008).

Les années suivantes, la belle Virginie continue de s'illustrer dans diverses productions aux tonalités éclectiques : comédie avec L'Emmerdeur, film de guerre dans L'Armée du crime, la comédienne aux multiples casquettes va même jusqu'à jouer les pestes bourgeoises dans le succès inattendu de 2010, Tout ce qui brille. Après avoir tenu un rôle récurrent dans la série XIII, elle retrouve Benoît Jacquot en 2012 pour un film historique en costumes intitulé Les Adieux à la reine.

Virginie Ledoyen plonge ensuite dans l'univers d'Emmanuel Mouret avec Une autre vie (2014) où elle interprète l'épouse trahie de JoeyStarr. La même année, on peut la voir dans Ablations, le premier film d'Arnold de Parscau, un thriller sur le trafic d'organe dans lequel la comédienne campe la femme de Denis Ménochet.

En 2015, c'est au casting d'un autre premier film, celui d'Enragés d'Eric Hannezo, qu'on la retrouve en compagnie notamment de Lambert Wilson. Virginie Ledoyen incarne une otage kidnappée par quatre criminels après un braquage qui a mal tourné. Trois ans plus tard, la comédienne de 41 ans donne la réplique à Axelle Laffont et Marie-Josée Croze dans MILF, qui voit trois femmes approchant de la quarantaine devenir le fantasme de trois jeunes garçons...