Fille d'un géologue, Florence Loiret Caille passe son enfance en Indonésie. De retour en France, elle prend des cours de comédie dans un petit conservatoire de banlieue, tout en faisant sa première apparition au cinéma en 1996 dans Seule, court métrage signé par un réalisateur prometteur, Erick Zonca. On l'aperçoit bientôt chez Martine Dugowson, Benoît Jacquot ou Michael Haneke (Code inconnu et plus tard Le Temps du loup).

En 2001, Florence Loiret Caille incarne l'employée d'hôtel qui se fait dévorer par Vincent Gallo dans le dérangeant Trouble Every Day de Claire Denis, une réalisatrice qu'elle retrouvera à plusieurs reprises. Au même moment, une belle complicité se noue avec le jeune Jérôme Bonnell, qui lui offre le rôle de la secrète et boudeuse Emma dans Le Chignon d'Olga (2002). Pour lui, elle interprète avec finesse une prostituée dans J'attends quelqu'un (2006) avant d'être l'héroïne de La Dame de trèfle (2009).

Tantôt sauvage tantôt gouailleuse, l'actrice, de plus en plus sollicitée, incarne la serveuse dont s'éprend Jamel dans Parlez-moi de la pluie, une prestation très remarquée. Après avoir été la narratrice d'Une aventure devant la caméra de Xavier Giannoli (2005), elle écoute le récit de Daniel Auteuil dans Je l'aimais de Zabou Breitman (2009). La même année, on la retrouve dans Au voleur, de Sarah Leonor et dans La Dame de trèfle, de Jérôme Bonnell, deux drames intimistes relatant une histoire d'amour impossible.

En 2010, elle interprète une infirmière à domicile obstinée dans la comédie dramatique La Petite Chambre, premier long métrage de Stéphanie Chuat et Véronique Reymond. Dans la peau d'une jeune femme qui cherche à adopter, elle continue dans le registre de la comédie avec Et soudain, tout le monde me manque (2011), de Jennifer Devoldere, et revient ensuite à son genre fétiche, avec le drame L'Hiver dernier, western crépusculaire hybride réalisé par John Shank.