Fils d’un vétérinaire et d’une assistante sociale, Jean-Hugues Anglade entre en 1975 au Conservatoire National Supérieur d'Art Dramatique de Paris, où il suit les cours d’Antoine Vitez. Parallèlement, il tourne dans quelques téléfilms (Un comique né, de Michel Polac, La Peau de chagrin), avant de débuter en 1982 au cinéma dans L'Indiscrétion de Pierre Lary.

Un an plus tard, Patrice Chéreau le révèle dans L'Homme blessé, où il campe un individu tourmenté par la découverte de son homosexualité. Ce premier rôle marquant lui vaut une nomination au César du meilleur espoir masculin. Après avoir donné la réplique à Michel Piccoli dans La Diagonale du fou, Jean-Hugues Anglade chausse les patins du Roller de Subway, deuxième long métrage de Luc Besson. Mais c’est avec 37°2 le matin, adaptation culte du livre de Philippe Djian par Jean-Jacques Beineix, que l’acteur obtient ses galons de star. Il y partage l’affiche et quelques scènes torrides avec Béatrice Dalle. Nouvelle nomination aux César, du meilleur acteur cette fois-ci.

Après avoir recroisé Michel Piccoli dans Maladie d'amour, il tourne sous la direction d’Alain Corneau dans Nocturne indien, puis retrouve Luc Besson l’année suivante pour Nikita. N’hésitant jamais à se mettre à nu (au sens propre comme figuré), cette figure romantique enchaîne sur le très charnel Nuit d'été en ville, avec de Marie Trintignant.

Après une incursion dans la comédie chorale (Les Marmottes) Jean-Hugues Anglade est en 1993 le Charles IX de Patrice Chéreau dans La Reine Margot, rôle qui lui vaut le César du meilleur second rôle. L’acteur interprète ensuite un braqueur ultra-violent au verbe inspiré dans le Killing Zoe de Roger Avary. Rompant avec le baroque de ces deux films, il joue en 1995 sous la direction de Claude Sautet dans Nelly et Monsieur Arnaud, le dernier film du cinéaste.

En 1996, Jean-Hugues Anglade passe à la réalisation avec Tonka, dans lequel il dirige sa compagne Pamela Soo, mais le film reçoit un accueil glacial, ouvrant une période moins faste pour l’acteur, qui participe au Risque maximum emmené par Jean-Claude Van Damme. Le Prof, Sueurs ou Mortel transfert, qui signe ses retrouvailles avec Jean-Jacques Beineix, sont autant d’échecs critiques et/ou commerciaux. L’acteur est toutefois du premier film de Valeria Bruni Tedeschi (Il est plus facile pour un chameau...), et donne la réplique à Angelina Jolie dans Taking lives, destins violés.

Incarnation du commissaire Adamsberg de Fred Vargas pour la télévision, c’est justement grâce au petit écran qu’il renoue en 2009 avec le succès dans Braquo, série policière survoltée d’Olivier Marchal. Après avoir de nouveau travaillé sous la direction de Patrice Chéreau (Persécution) et joué avec Isabelle Huppert dans Villa Amalia, c’est dans la peau du petit flic de province corrompu et pédophile de Mineurs 27 que Jean-Hugues Anglade revient en 2011, aux côtés de jeunes acteurs prometteurs (Nassim Si Ahmed, Finnegan Oldfield, Marie-Ange Casta).

Parallèlement à la série Braquo, le comédien se livre à un amour interdit avec Ana Girardot, la fille de son meilleur ami Gérard Lanvin dans Amitiés sincères, puis côtoie Louise Bourgoin dans le drame Je suis un soldat qui évoque le trafic canin.