C'est dès l'âge de 16 ans que Clotide Courau décide d'embrasser sa carrière artistique. Elle intègre le Cours Florent un peu plus tard, puis elle se produit dans plusieurs pièces de théâtre. Ces expériences lui permettent d'approcher le monde du cinéma, et en 1990 elle décroche le rôle féminin principal du Petit criminel, de Jacques Doillon, recevant dans la foulée un prix au Festival Européen de Berlin et une nomination pour le César du Meilleur espoir féminin.

Ce rôle lui permet également de se faire remarquer à Hollywood, où le réalisateur Paul Mazursky fait appel à elle, l'année suivante, pour donner la réplique à Danny Aiello dans The Pickle. Pendant deux ans, Clotilde Courau se consacre au théâtre, ne faisant que quelques apparitions sur grand écran. Le public français la redécouvre dans Elisa en 1995 où elle joue la meilleure amie de Vanessa Paradis, et décroche à nouveau une nomination pour le César du Meilleur espoir féminin.

Devenue une actrice incontournable du paysage cinématographique français, Clotilde Courau enchaîne les tournages, se révélant juste dans tous les genres et les registres. Elle promène ainsi son sourire entre drame romantique (Marthe, 1997), comédie noire (Le Poulpe, 1998) et thriller (Exit, 2000). En 2000, le jeune public la découvre dans le premier slasher français, Promenons-nous dans les bois.

La tournée triomphale de la pièce musicale Irma la Douce l'éloigne quelque peu des studios, mais elle fait un retour fracassant sur les écrans en 2002, à l'affiche de cinq films, dont Le Nouveau Jean-Claude de Didier Tronchet, Embrassez qui vous voudrez de Michel Blanc, ou la première réalisation de Guillaume Canet, Mon idole.

De nouveau tenue loin des plateaux de cinéma, suite à son mariage avec le prince Emmanuel II de Savoie, elle y revient en deux étapes : d'abord en 2005,à l'affiche de Nuit noire 17 octobre 1961 d'Alain Tasma; puis, surtout, en 2007, dans La Môme, succès public et critique d'Olivier Dahan qui la voit se glisser dans la peau de la mère d'Edith Piaf, interprétée par Marion Cotillard. 2008 est pour Clotilde une année placée sous le signe de l'amour, puisqu'on la retrouve au générique de Modern Love.

En 2011, elle est à l’affiche de Tous les soleils de Philippe Claudel aux côtés de Stefano Accorsi et en 2014 de Babysitting de Philippe Lacheau. Clotilde sera prochainement dans le film de Philippe Garrel, L’Ombre des femmes et L’échappée belle de Emilie Cherpitel. Côté théâtre, elle incarne Piaf, l’être intime accompagné de l’accordéoniste Lionel Suarez, en tournée province, pièce dont elle assure la mise en scène.

Après avoir pris part au léger et très lucratif Babysitting, Clotide Courau tourne deux fois sous la direction de Marie-Castille Mention-Schaar : tout d'abord dans Le Ciel attendra (2015) qui traite du sujet difficile de l'embrigadement de jeunes par l’Etat islamique puis dans le film choral La Fête des mères (2018). Parallèlement, la comédienne goûte aux joies du petit écran avec la série d'espionnage La Source.

Active sur les plateaux de cinéma, la native de Levallois-Perret fait office de second rôle plus ou moins marquants dans Une fille facile, Les Héroïques, Benedetta, Haute Couture, Le Médecin imaginaire, L'Été dernier et Le Théorème de Marguerite. On la voit également dans deux mini-séries, Rebecca et L'Absente, ainsi que le téléfilm dramatique La Cour de Hafsia Herzi, où elle campe une directrice d'école bouleversée par l'arrivée d'une nouvelle élève en plein milieu d'année scolaire.