Issue d'une famille de nobles alsaciens protestants, Charlotte de Turckheim se rebelle vite et refuse après son bac de suivre des études de droit pour faire du théâtre. Elle apparaît pour la première fois au cinéma en 1980 dans un film fantastique La Nuit de la mort de Raphael Delpard, et enchaîne ensuite avec des petits rôles dans des comédies populaires comme Les Sous-doués en vacances de Claude Zidi, Le Maitre d'école de Claude Berri (1981), Les Babas cool de François Leterrier (1981) où elle joue la femme de Christian Clavier et Ma femme s'appelle reviens de Patrice Leconte (1982).

Elle nuance quelque peu son image de femme à la forte personnalité dans des films comme Edith et Marcel de Claude Lelouch (1982), Un amour de Swann de Volker Schlöndorff aux côtés de Jeremy Irons (1984) ou encore Rive droite, rive gauche de Philippe Labro (1984).

A partir de la fin des années 80, ses apparitions au cinéma se font plus rares, même si elle se fait remarquer dans des productions comme Chouans ! de Philippe de Broca en aristocrate contre-révolutionnaire et Une époque formidable... de Gérard Jugnot (1991). En 1992, Une Journée chez ma mère, tiré de sa pièce éponyme où elle parle de sa famille haute en couleurs, lui permet de tenir son premier vrai rôle principal au cinéma. Après avoir été dirigée par James Ivory dans Jefferson à Paris (1995), la comédienne passe à la réalisation avec Mon père, ma mère, mes frères et mes sœurs... (1999) où elle s'inspire là encore de sa famille.

Charlotte de Turckheim n'en délaisse pas pour autant son métier d'actrice, s'affichant en 2001 dans un film américain de Neil Hollander intitulé Birds of Passage, centré sur la politique de l’enfant unique en Chine. L'année suivante, elle est dirigée par Eric Assous dans la comédie Sexes très opposés où elle incarne une croqueuse d'hommes sans scrupules. Mais c'est à l'intérieur du petit écran que la comédienne apparaît le plus au cours des années 2000. Ainsi, elle occupe le rôle vedette de la série Madame Le Proviseur entre 1994 et 2006 et incarne la Reine dans Jeanne Poisson, Marquise de Pompadour (2006) aux côtés de Vincent Perez.

Dotée d'une importante carrière à la télévision (L'Affaire Finaly, Clara Sheller, Le Grand ménage, La plus pire semaine de ma vie, etc.), elle n’en oublie pas pour autant le cinéma et réalise Les Aristos en 2006. Aussi populaire auprès du public sur petit que sur grand écran, en 2011, elle embarque pour La Croisière et retrouve pour l’occasion Antoine Duléry après Sexes très opposés. L'année suivante, Charlotte de Turckheim passe derrière la caméra pour la troisième fois avec la comédie Mince alors ! pour laquelle elle retrouve son actrice fétiche Victoria Abril. La cinéaste y aborde la question du surpoids.

Le succès commercial du film (pas loin d'1,5 millions d'entrées en France) lui permet de se lancer presque dix ans plus tard dans sa suite, Mince alors 2 !. Entre ces deux opus, Charlotte de Turckheim privilégie la comédie comme à son habitude, et apparaît dans Avis de mistral (2014), Qui c'est les plus forts ? (2015, et qu'elle réalise également), Loue-moi ! (2017) et Abdel et la Comtesse (2018). Egalement active à la télévision, on peut la voir dans les téléfilms Les Tourtereaux divorcent, Merci pour tout Charles et La permission, ainsi que dans les séries Vive la colo ! ou Scènes de ménages.