Steve Zahn commence sa carrière de comédien au théâtre en obtenant le premier rôle d'une pièce se jouant dans son Minnesota natal, Biloxie blues. Cette première expérience le conduit à partir 13 mois avec la compagnie de Tommy Tune pour jouer Bye bye Birdie. Il côtoie alors sur les planches, Ethan Hawke et rencontre sa future femme, Robyn Peterman. Remarqué par Ben Stiller, il participe à Génération 90 en 1994.

Les tournages s'enchaînent. Il incarne un jeune sous-marinier dans USS Alabama en 1995, un jeune paumé dans SubUrbia en 1996, et un délinquant dans Hors d'atteinte en 1998. En parallèle, il fait une rencontre déterminante, celle de Tom Hanks, qui le fait jouer dans son premier film en tant que réalisateur, le rétro That Thing you do en 1996. Les deux acteurs se retrouveront deux ans plus tard devant la caméra de Nora Ephron dans Vous avez un message.

Mais c'est en 1999, qu'il se fait définitivement remarquer par les professionnels d'Hollywood et les producteurs indépendants, grâce à Happy, Texas (Mark Illsley). Sa performance est récompensée aux Film Independent Spirit Awards et à Sundance. Dès lors, il multiplie les rôles. En 2001, il joue dans le thriller Une virée en enfer (John Dahl), remake plus ou moins assumé de Duel de Steven Spielberg. On le retrouve ensuite dans la romance Un vent de folie ; la comédie Diablesse aux côtés de Jason Biggs et Jack Black ; et le drame Écarts de conduite où il campe le compagnon toxicomane de Drew Barrymore.

Steve Zahn devient bientôt pour Hollywood l'acteur idéal de buddy-movie, jouant le faire-valoir drôle et attachant de Martin Lawrence dans National security (2003), puis celui d'Eddie Murphy dans École paternelle (id.), et enfin celui de Matthew McConaughey dans le film d'aventures à grand spectacle Sahara (2005).

Le comédien dit accepter avec plaisir et philosophie ces rôles tout en continuant à jouer dans de plus petites productions comme Le Mystificateur (2003) sur l'histoire vraie d'un jeune journaliste-reporter qui a inventé la majorité de ses articles dans les années 1990 ; le drame Speak (2004) face à une Kristen Stewart adolescente dans le rôle d'une victime de viol ; et Rescue Dawn (2006) de Werner Herzog, inspiré du destin d'un pilote de l'armée américaine luttant pour sa survie durant la guerre du Vietnam.

Dans un registre plus léger, il participe au doublage de plusieurs films familiaux, comme Stuart Little et sa suite, et les animés Chicken Little et 3 cochons et un bébé.

Après avoir affronté les Bandidas Salma Hayek et Penélope Cruz en 2006, Steve Zahn enchaîne les productions restées pour la plupart confidentielles en France, telles que Mister Showman, Strange Wilderness, Love Manager, Night Train et Escapade fatale. Au début des années 2010, il joue le rôle du père de Zachary Gordon et de ses nombreux frères dans la saga familiale Journal d'un dégonflé.

Après avoir tourné dans l'Oscarisé Dallas Buyers Club, c'est du côté de la petite lucarne que l'on retrouve le comédien. Ainsi, il obtient un rôle important dans la série plébiscitée par la critique Treme (2010 - 2013), celui d'un éternel adolescent extrêmement en phase avec la vie mouvementée et musicale du célèbre quartier de la Nouvelle-Orléans. Il enchaîne ensuite avec deux séries dans lesquelles il joue le rôle principal mais qui se voient rapidement annulées (Mind Games et Mad Dogs).

Steve Zahn fait son retour au cinéma en 2016 avec l'utopiste Captain Fantastic. Il prête ensuite sa gestuelle à l'un des primates du spectaculaire La Planète des Singes - Suprématie, et participe à l'émouvant La Route sauvage. S'il ne chôme pas, il faut attendre 2021 et la première saison de The White Lotus pour le revoir dans un projet qui crée l'événement. Son interprétation d'un père de famille anxieux persuadé d'avoir un cancer lui vaut d'être nommé aux Emmy Awards.

La télévision lui portant chance, il enchaîne les seconds rôles dans des séries (George & Tammy, The Righteous Gemstones, Silo, Chad Powers) durant les années 2020. En 2025, il tient le haut de l'affiche d'Anaconda, remake méta et comique du long-métrage de 1997 avec Jennifer Lopez.