Après avoir suivi différents cours de théâtre et embrassé une carrière de danseuse de cabaret, Florence Thomassin se dirige vers le septième art dans les années 80 en interprétant des petits rôles dans des courts ou moyens métrages. En 1995, dans Elisa de Jean Becker, elle se distingue dans le rôle de la mère (en flash-back) de Vanessa Paradis, avant de se faire remarquer en croqueuse d'hommes dans Ainsi soient-elles.

Florence Thomassin passe de femme très sensuelle (Le Plaisir et ses petits tracas) à femme fragile, nommée aux Césars dans la catégorie Meilleur second rôle féminin pour Une Affaire de Gout de Bernard Rapp en 2000. La même année avec Rien à faire, elle montre qu'elle est aussi crédible en prolétaire qu'en bourgeoise blasée. Après avoir remporté le prix de la meilleure comédienne au Festival de Saint Tropez pour le téléfilm Les Vilains de Xavier Durringer, elle enchaîne les rôles sur petit puis sur grand écran, notamment dans Le Coeur des hommes, où le personnage de Jean-Pierre Darroussin tombe amoureux d'elle, ou dans Douches froides où elle interprète la mère du jeune héros (Johan Libéreau).

L'un de ses succès au cinéma se passera d'images: narratrice dans Un long dimanche de fiançailles de Jean-Pierre Jeunet, elle impose en voix off son timbre troublant. En 2006, c'est la consécration, elle est à l'affiche de Président, du Grand Meaulnes et du polar sombre Ne le dis à personne de son ami Guillaume Canet. Elle alterne aisément les registres, retrouvant l'année d'après Marc Esposito et toute l'équipe pour Le Coeur des hommes 2.

Prostituée violentée dans Mesrine : L'Instinct de mort (2008), Florence Thomassin s'inscrit au générique de Tête de Turc, drame mis en scène par Pascal Elbé. Après un rôle dans Roses à crédit d' Amos Gitaï, elle est la Marquise de Mézières de Bertrand Tavernier dans La Princesse de Montpensier (2010), sélectionné au Festival de Cannes 2010.