Fille d'un ingénieur et d'une prof de maths, Catherine Frot entre à 17 ans à l'École de la Rue Blanche, puis au Conservatoire. Co-fondatrice en 1978 de la Compagnie du Chapeau Rouge, à laquelle se joindra bientôt Jean-Pierre Darroussin, elle fait sa première apparition à l'écran en 1980 dans Mon oncle d'Amérique de Resnais. Tout en continuant de se consacrer essentiellement au théâtre, elle trouve quelques petits rôles au cinéma (Psy, Elsa, Elsa, Chambre à part). Voisine de Robin Renucci dans Escalier C, elle obtient pour cette prestation une nomination au César du meilleur second rôle.

Au milieu des années 90, Catherine Frot triomphe sur les planches dans Un air de famille, le spectacle d'Agnès Jaoui et de Jean-Pierre Bacri : elle y interprète Yoyo, la belle-sœur nunuche, un personnage drôle et attendrissant qui lui vaut le Molière du second rôle. Lorsque Cédric Klapisch adapte la pièce à l'écran, le succès est encore au rendez-vous, et l'actrice décroche un César en 1997. Abonnée aux rôles de bourgeoise un peu pincée, elle enchaîne alors les comédies : maîtresse de Thierry Lhermitte dans Le Dîner de cons de Francis Veber (1998), elle apparaît également dans Paparazzi puis dans La Nouvelle Eve un an plus tard.

En 1999, Catherine Frot est pour la première fois en haut de l'affiche grâce à La Dilettante, succès-surprise de Pascal Thomas, dans lequel elle campe une provinciale au caractère bien trempé. Elle retrouve plus tard le cinéaste, à l'occasion d'une joyeuse virée chez Agatha Christie (Mon petit doigt m'a dit, en 2005, et ses deux suites : Le Crime est notre affaire, en 2008, et Associés contre le crime... en 2012) dans laquelle elle joue une détective un brin décalée. Avec sa voix un rien gouailleuse, l'actrice s'illustre dans des comédies (Chouchou, 7 ans de mariage) qui assoient encore un peu plus sa popularité.

Mais elle dévoile bientôt d'autres facettes de son talent : vedette de Chaos (2001), film engagé de Coline Serreau, elle incarne avec retenue la terroriste repentie de la trilogie de Lucas Belvaux (2003), la pianiste secrète de La Tourneuse de pages (2006) ou la mère inquiète de L' Empreinte de l'ange. Héroïne d’œuvres qui revisitent le patrimoine national (Vipère Au Poing, Boudu), Frot ajoute aussi de nouveaux spécimens à sa galerie de femmes candides et décalées (Les Sœurs fâchées en 2005, Odette Toulemonde en 2007). S'essayant au film d'animation (Cendrillon & le prince (pas trop) charmant), elle se grime en vieille dame pour les besoins du Vilain (2009) d’Albert Dupontel. Elle alterne comédies grand public (Imogène McCarthery) et projets plus singuliers (Les Derniers jours du monde en 2009 ou le polar social Coup d'éclat en 2011).

Cependant, la comédie reste l'un des genres préférés de l'actrice. En 2012, elle tient ainsi le rôle principal de Bowling aux côtés de Mathilde Seigner et d'actrices comiques comme Laurence Arne et Firmine Richard, avant de retrouver ensuite d'anciennes connaissances (Pascal Thomas, André Dussollier et son personnage de Prudence Beresford). La même année, c'est à un nouveau venu qu'elle donne la réplique dans Les Saveurs du palais : Jean D'ormesson. Dans le film, elle incarne la première femme cuisinière à l’Élysée, choisie par un François Mitterrand qu'interprète le célèbre académicien.

En 2015, Catherine Frot accède à la consécration en remportant le César de la meilleure actrice pour sa performance dans Marguerite de Xavier Giannoli. Elle y campe Marguerite Dumont, une femme fortunée passionnée de musique et d’opéra. Depuis des années elle chante régulièrement devant son cercle d’habitués. Mais Marguerite chante tragiquement faux et personne ne le lui a jamais dit. Son mari et ses proches l’ont toujours entretenue dans ses illusions. Tout se complique le jour où elle se met en tête de se produire devant un vrai public à l’Opéra. Deux ans plus tard, la comédienne est à l'affiche de Sage Femme et donne la réplique à Catherine Deneuve. Elle devient ensuite la femme de Christian Clavier dans la comédie Momo.