Soldat dans la Marine américaine pendant la Deuxième Guerre Mondiale, Harry Dean Stanton suit une formation de comédien au Pasadena Playhouse avant de débuter sur le grand écran dans le western Tomahawk trail en 1957. Très actif dans le domaine des séries télévisées, l'acteur poursuit également sa carrière au cinéma. Véritable "gueule", il obtient régulièrement des petits rôles dans des films de série B, tels L'Ouragan de la vengeance de Monte Hellman en 1965, où il partage l'affiche avec Jack Nicholson qui deviendra l'un de ses proches.

Série B et petits rôles toujours pour La Poursuite des tuniques bleues co-réalisé par Roger Corman en 1967, puis dans Luke la main froide de Stuart Rosenberg (1967), et Le Jour des apaches de Jerry Thorpe (1968). En 1973, Harry Dean Stanton retrouve le western pour Pat Garrett et Billy le Kid de Sam Peckinpah. C'est le début d'une série de collaborations avec quelques-uns des plus grands noms du cinéma américain des années 70 : Dillinger de John Milius en 1973, un petit rôle dans Le Parrain, 2ème partie de Francis Ford Coppola un an plus tard, ou encore Alien, le huitième passager de Ridley Scott et Le Malin de John Huston en 1979. Entre temps, le comédien apparaît dans le film noir Adieu, ma jolie (1975) ou collabore avec Dustin Hoffman dans Le Recidiviste d'Ulu Grosbard, trois ans plus tard.

Petit détour par la France pour rejoindre le casting international de La Mort en direct de Bertrand Tavernier en 1980, avant de poursuivre les collaborations prestigieuses, toujours en second couteau : cette fois, ce sont John Carpenter dans New York 1997 (1981) et Christine (1983), Wim Wenders dans Paris, Texas (1984), Martin Scorsese dans La Derniere Tentation du Christ (1988), John Frankenheimer dans The Fourth War et David Lynch dans Sailor et Lula (1990) et Twin Peaks qui filment le comédien rebelle. Sans oublier une deuxième collaboration avec Francis Ford Coppola dans Coup de coeur (1982) et la comédie dramatique Mr North tournée en 1988 sous la direction de Danny Huston.

Toujours présent dans ses éternels seconds rôles, le comédien mélange habilement films de studios Prejudice (1998), La Ligne verte (1999) et productions indépendantes comme She's so lovely de Nick Cassavetes (1997), Las Vegas Parano de Terry Gilliam un an plus tard ou encore The Pledge (2001) de Sean Penn avec son ami Jack Nicholson. En 2002, Harry Dean Stanton retrouve Nicolas Cage qui réalise son premier long métrage, le drame Sonny.

Suivent les comédies Self control et La Grande arnaque ainsi que le documentaire Bukowski, dans lequel il incarne un romancier à la fois poète et alcoolique. En 2004, il tourne dans Chrystal avant de jongler l'année suivante avec des genres différents tels que le film de science fiction Alien Autopsy, le drame Alpha Dog, puis la comédie romantique The Wendell Baker Story. L'inclassable INLAND EMPIRE lui permet de retrouver son réalisateur fétiche David Lynch et Laura Dern avec qui il avait tourné dans Sailor et Lula.

Côté petite lucarne, Harry Dean Stanton interprète un personnage assez important de la série HBO plébiscitée par la critique, Big Love, celui de Roman Grant, tête pensante d'une secte polygame qui est aussi le père de Nicolette Grant et Alby Grant. Après l'arrêt de la série en 2010, le comédien poursuit sa carrière au cinéma et enchaîne les petits rôles dans des films variés à l'image du drame This Must Be the Place, du blockbuster Avengers ou encore du biopic Frank and Ava. En 2017, il prend part à un épisode de la troisième saison de Twin Peaks. Il décède le 15 septembre 2017 à Los Angeles, à l'âge de 91 ans. Son dernier film, Lucky, avec David Lynch au casting, sortira le 13 décembre 2017 en France.