Fille de Serge Gainsbourg et de Jane Birkin.

Filleule de Yul Brynner, Charlotte Gainsbourg est initiée très tôt au piano, et songera longtemps à se diriger vers la peinture. Sur un plateau de cinéma dès l'âge de 12 ans (elle incarne la fille de Catherine Deneuve dans Paroles et Musique), elle se fait connaître par une chanson, Lemon incest, interprétée en duo avec son père, qui lui écrira par la suite un album entier, Charlotte for ever, titre également d'un film, controversé, qu'il réalisera en 1986. Le grand public découvre l'actrice en 1985 dans L' Effrontée de Claude Miller. Son émouvante composition de jeune fille rebelle et complexée lui vaut le César du Meilleur espoir féminin. Miller lui offre trois ans plus tard un nouveau rôle d'enfant sauvage dans La Petite Voleuse.

Formant avec Anouk Grinberg un tandem détonant dans Merci la vie de Blier, elle impose un talent et une personnalité propres, faisant oublier sa prestigieuse ascendance, ce qui ne l'empêche pas de tourner sous la direction de son oncle, Andrew Birkin (Cement Garden en 1993, son premier film en anglais), ou de son beau-père Jacques Doillon (Amoureuse). Pourtant, dans les années 90, Charlotte Gainsbourg est peu sollicitée par un cinéma français qui semble lui reprocher de ne plus être l'adolescente farouche de ses débuts. On signalera cependant la sortie en 1996 de Love etc. et de la coproduction européenne Jane Eyre.

Se révélant aussi douée pour la comédie que pour le drame, Charlotte Gainsbourg décroche en 2000 un César du Meilleur Second rôle grâce à La Bûche, film qui lui permet aussi de renouer avec le succès populaire. Un an plus tard, on la retrouve dans le premier long d'Yvan Attal, Ma femme est une actrice, regard décalé sur le métier de comédien, doublé d'une déclaration d'amour d'un cinéaste à sa compagne, rencontrée onze ans plus tôt sur le tournage d'Aux yeux du monde - le couple poursuit sa collaboration avec Ils se marièrent et eurent beaucoup d'enfants en 2004.

Naviguant entre gravité (L'Un reste, l'autre part) et légèreté (Prête-moi ta main), Charlotte Gainsbourg est sollicitée par les talents les plus originaux du cinéma français, tels Moll et son inquiétant Lemming en 2005 ou Gondry et sa farfelue Science des rêves en 2006. Mais celle qui enregistre en 2006 un deuxième album entièrement en anglais, mène désormais une carrière internationale : épouse de Sean Penn dans 21 grammes d'Inárritu en 2004, elle tourne en Argentine The Golden door (2006), film d'époque de l'Italien Crialese avant de rejoindre le luxueux casting de I'm not there, évocation de la vie de Dylan par Todd Haynes et d'être dirigée par le Danois provocateur Lars von Trier dans Antichrist, film d'épouvante présenté à Cannes en 2009.

Honorée du prestigieux Prix d'Interprétation Féminine pour ce film, l'actrice poursuit dans le registre dramatique, en vivant une relation tortueuse avec Romain Duris dans le troublant Persécution de Patrice Chéreau, avant d'interpréter une mère de famille frêle mais déterminée dans L'Arbre de Julie Bertuccelli.En 2011, Charlotte retrouve le réalisateur Lars von Trier pour son film Melancholia, une histoire de mariage et de fin de vie sur la Terre, dans lequel elle donne la réplique à Kirsten Dunst. Elle accompagne par la suite les débuts d'acteur du rocker Pete Doherty dans Confession d'un enfant du siècle, l'adaptation de l'oeuvre de Musset par Sylvie Verheyde. L'année suivante, le réalisateur danois fait de nouveau appel à elle pour les polémiques Nymphomaniac - Volume 1 et Volume 2, longs métrages érotico-dramatiques initialement prévus en un seul et même film, mais finalement divisés en deux à la demande des producteurs.

En 2014, elle partage l’affiche de Jacky au royaume des filles, la nouvelle comédie de Riad Sattouf, avec Vincent Lacoste.

Aimant tourner sous la houlette de prestigieux metteurs en scène aux styles variés, Charlotte Gainsbourg joue pour Michel Spinosa (Son épouse), Benoît Jacquot (3 cœurs, Suzanna Andler), Wim Wenders (Every Thing Will Be Fine), Roland Emmerich (Independence Day: Resurgence), Arnaud Desplechin (Les Fantômes d'Ismaël), Eric Barbier (La Promesse de l'aube), Gaspar Noé (Lux Æterna) et Mikhaël Hers (Les Passagers de la nuit). Elle n'en oublie pas son mari Yvan Attal et prend part à ses réalisations Ils sont partout et Mon chien Stupide. Par ailleurs, elle signe fin 2021 son premier long métrage, l’émouvant documentaire Jane par Charlotte, centré sur sa mère.