Robert De Niro grandit dans le quartier de Little Italy à New York. Il quitte l'école à seize ans pour suivre les cours d'art dramatique du Dramatic Workshop du Luther James Studio et de l'école de théâtre de Stella Adler. Il suit également l'enseignement de Lee Strasberg à l'Actors' Studio, où il fait la rencontre d'Harvey Keitel, qu'il retrouvera à plusieurs reprises au long de sa carrière. Il monte pour la première fois sur scène dans L'Ours d'Anton Tchekhov, et fait des débuts discrets au cinéma, en 1965, comme figurant dans le film de Marcel Carné, Trois chambres à Manhattan.

Un an plus tard, Robert fait la connaissance de Brian De Palma avec qui il tourne trois comédies semi-improvisées : The Wedding Party (1966), Greetings (1968) et Hi, Mom ! (1969). Mais c'est Martin Scorsese qui révèle ses talents de comédien au grand public grâce au polar Mean Streets (1973), dans lequel il interprète le fougueux Johnny Boy. L'année suivante, son personnage de jeune Vito Corleone dans Le Parrain, 2ème partie de Francis Ford Coppola lui vaut l'Oscar du Meilleur second rôle, et après sa troublante performance dans Taxi Driver (1976), il s'affirme comme un acteur de composition, épousant totalement le profil de ses rôles. Perfectionniste, il n'hésite pas à apprendre le saxophone pour la comédie musicale New York, New York (1977), à vivre aux côtés de mineurs-sidérurgistes pour Voyage au bout de l'enfer (1978), à prendre trente kilos pour jouer un boxeur sur le déclin dans Raging Bull (1980), performance qui lui vaut l'Oscar du Meilleur acteur, ou encore à apprendre la messe en latin pour les besoins de Sanglantes confessions (id.).

Parallèlement à la fructueuse collaboration qu'il poursuit avec Martin Scorsese (La Valse des pantins, Les Affranchis, Les Nerfs à vif, Casino), Robert De Niro joue la carte de la diversité avec plus ou moins de succès. On le retrouve ainsi au générique de films de gangsters, dont il s'est fait une spécialité (Il était une fois en Amérique, Les Incorruptibles), de films d'anticipation (Brazil, 1985), de fresques historiques (Mission, Palme d'or à Cannes en 1986), de thrillers surnaturels comme Angel Heart (1987) ou encore de comédies comme Midnight Run (1988). Également fidèle au cinéaste Irwin Winkler (La Liste noire, La Loi de la nuit), l'acteur s'essaie en 1994 à la réalisation, avec le drame Il était une fois le Bronx. Douze ans plus tard, il réitérera l'expérience avec Raisons d'Etat, centré sur la naissance de la CIA. Entre-temps, il se mesure à quelques cadors comme Kenneth Branagh, pour qui il interprète la créature de Frankenstein en 1995, Al Pacino (Heat, et douze ans plus tard La Loi et l'ordre), Sylvester Stallone (Copland, 1997), Dustin Hoffman (Des hommes d'influence, 1998) ou Marlon Brando (The Score, 2001).

Après avoir tourné en 1998 sous la houlette de deux "pointures" (Quentin Tarantino pour Jackie Brown et John Frankenheimer pour le film d'action Ronin), Robert De Niro "cachetonne" dans des comédies grand public comme Mafia Blues (1999) et sa suite (2003), Personne n'est parfait(e) (2000), Showtime (2001) ou encore la trilogie Mon beau-père et moi. On le voit également s'égarer dans des thrillers de peu d'intérêt (15 minutes, Père et flic, Godsend, Trouble jeu), mais il parvient toutefois à surprendre en s'illustrant dans des registres auxquels il n'était guère habitué jusqu'à présent, comme l'animation (Gang de requins, Arthur et les Minimoys) et l'heroic fantasy (Stardust, le mystère de l'étoile), tout en s'éloignant d'un jeu parfois caricatural et trop "grimaçant" (Panique à Hollywood, Everybody's Fine).

En 2010, l'acteur est à l'affiche de la comédie d'action Machete de Robert Rodriguez et Ethan Maniquis, où il interprète un sénateur véreux. D'un rôle de sénateur au cinéma, il devient dans la vie le 64e président du jury du Festival de Cannes en 2011, où il consacre The Tree of Life de Terrence Malick. La même année, il s'illustre dans pas moins de cinq films, aux genres très différents : les thrillers Stone et Limitless, le film d'action Killer Elite et les comédies romantiques Happy New Year et L'Amour a ses raisons (tourné en italien, langue qu'il n'avait plus utilisée à l'écran depuis Le Parrain, 2ème partie, 37 ans plus tôt). L'année suivante, c'est dans le rôle du père marginal de Paul Dano, dans le drame Monsieur Flynn, qu'on le retrouve. Cette même année, il est également à l'affiche de Red Lights et Unités d'Elite, deux films qui ne parviennent pas à redorer le blason de la grande star qu'il était.

L'Italo-Américain refait toutefois rapidement parler de lui en 2013, à l'occasion de la comédie dramatique Happiness Therapy. Dans le rôle du paternel ahurissant de Bradley Cooper, il livre une prestation très remarquée. Il termine cette année avec deux comédies : Malavita de Luc Besson et Last Vegas où il partage l'affiche avec Morgan Freeman, Michael Douglas et Kevin Kline. En 2014, les Français voient Robert rehausser ses gants de boxe pour les besoins de Match Retour. Le comédien alterne ensuite le pire et le meilleur, caricaturant notamment ses rôles de mafieux dans L'Instinct de tuer ou Bus 657. Il délivre également une prestation gênante dans la comédie potache Dirty Papy aux côtés de Zac Efron. Mais De Niro démontre finalement qu'il reste un des plus grands acteurs, brillant par exemple dans The Comedian, dans lequel il campe un personnage proche de Rupert Pupkin de La Valse des Pantins.

L'artiste interprète ensuite l'entraîneur de boxe Ray Arcel dans Hands of Stone, biopic centré sur le boxeur panaméen Roberto Duràn. L'acteur reste dans le biopic en prêtant ses traits au sulfureux financier Bernard Madoff, l'escroc de Wall Street, dans The Wizard of Lies. Ce dernier a été condamné en 2009 à 150 ans de prison pour avoir détourné près de 65 milliards de dollars. En 2019, De Niro se confronte au Joker en personne ! Il incarne un animateur de télévision qui va se retrouver opposé au clown prince du crime joué par Joaquin Phoenix. La même année, De Niro retrouve Martin Scorsese pour la 9ème fois dans The Irishman. Aux côtés de Joe Pesci et Al Pacino, le comédien campe le gangster Frank Sheeran, soupçonné d'avoir fait disparaître le dirigeant syndicaliste Jimmy Hoffa en 1975. Puis, il s'attaque à un registre plus léger avec les comédies Mon grand-père et moi, Arnaque à Hollywood et Mon père et moi.

En 2023, Robert De Niro retrouve Scorsese pour Killers of the Flower Moon, une fresque historique qui met en lumière une part sombre de l'Histoire américaine : la série de meurtres de la tribu native Osage, en Oklahoma, dans les années 1920.