Marqué par la prestation de Brel sur scène dans L'Homme de la Mancha, François Cluzet, fils d'un marchand de journaux du VIIe arrondissement, rêve très tôt de célébrité. Adolescent, il chante dans des groupes de rock, mais son amour des textes le porte vers la comédie. Quittant le lycée à 17 ans, il intègre le Cours Simon, puis ceux de Périmony et Cochet. Après des débuts sur les planches en 1976 et quelques téléfilms, il apparaît au cinéma en 1980 dans Cocktail Molotov de Diane Kurys. La même année, Claude Chabrol, qui deviendra son réalisateur-fétiche, lui confie un des rôles principaux de sa chronique paysanne en pays bigouden, Le Cheval d'orgueil. Ils se retrouveront dès 1982 pour Les Fantômes du chapelier.

L'année 1983 est très riche pour François Cluzet, frère de Pinpon-Souchon dans L'Eté meurtrier et enfant du peuple dans Vive la sociale, deux prestations qui lui vaudront en 1984 le Prix Jean-Gabin et une double nomination aux César (Meilleurs espoir et second rôle). Parfois comparé à Dustin Hoffman, l'acteur se révèle aussi à l'aise en prolo au grand coeur dans Force majeure (1989) qu'en chef d'entreprise malhonnête dans Association de malfaiteurs ou en Camille Desmoulins dans La Révolution française. Dans les années 80 toujours, il croise la route de Gatlif, Claire Denis, et tourne avec les deux Bertrand du cinéma français : Tavernier (le jazzy Autour de minuit en 1986) et Blier (Trop belle pour toi). Plus tard, il travaillera avec deux grands Américains, Altman et Kasdan.

Lui dont le modèle est Spencer Tracy dans Dr Jekyll et Mr Hyde incarne volontiers les individus troubles. Son mentor Chabrol lui offre le rôle du mari médiocre d'Huppert dans Une affaire de femmes, et celui, jaloux, de Béart dans L'Enfer (1994). Ce goût pour les personnages tourmentés le conduit à camper à plusieurs reprises des écrivains, sur un mode mélancolique (Fin août, début septembre) ou loufoque (L'Examen de minuit) et surtout Les Apprentis de Salvadori, un de ses plus gros succès, en 1995. Il s'illustre ensuite surtout dans la comédie, affichant une prédilection pour les doux dingues, comme en témoignent ses compositions délirantes dans France boutique de Tonie Marshall, Janis et John ou encore Quatre étoiles.

C'est pourtant sa prestation dans un thriller, Ne le dis à personne de Guillaume Canet (un des champions du box office 2006) qui lui vaudra son premier César. Il retrouvera l'acteur/réalisateur en 2008 pour Liens du sang. Devenu un acteur de tout premier plan, François Cluzet participe au luxueux film choral Paris de Cédric Klapisch et enchaîne les premiers rôles forts : alcoolique dans Le Dernier pour la route (2009), il se retrouve souvent dans des histoires d'escrocs et de gangsters en tous genres, comme dans A l'origine (2008) ou encore dans Blanc comme neige (2010). Pour Les Petits mouchoirs, sa troisième collaboration avec Guillaume Canet, François Cluzet joue avec brio les chefs de bande bien trop stressés, aux côtés de Marion Cotillard, Benoît Magimel, Gilles Lellouche et Jean Dujardin.

Cluzet n'hésite pas à se glisser dans la peau de personnages issus de différentes catégories sociales. Preuve en est en 2011, l'acteur passant d'un statut précaire dans Mon père est femme de ménage à un statut plus que confortable dans Intouchables, au sein duquel il campe le rôle d'un riche aristocrate se liant d'amitié avec quelqu'un de très différent de lui, interprété par le comique Omar Sy. Après le succès fulgurant d'Intouchables et ses 20 millions de spectateurs en France, Cluzet reste dans le registre de la comédie mais dans une optique plus légère. En effet, le comédien tourne avec et sous la direction d'Yvan Attal dans Do Not Disturb, l'histoire de deux amis qui se mettent en tête de tourner ensemble un porno gay amateur. Le film est malheureusement un échec critique et commercial.

En 2013, l'acteur détourne un fourgon blindé dans le thriller inspiré de faits réels de Philippe Godeau, 11.6. François se glisse dans la peau de Toni Musulin, convoyeur de fonds ayant mis la main sur un butin de 11.6 millions d'euros avant de se faire arrêter. La même année, il se perd en mer dans le drame maritime de Christophe Offenstein, En Solitaire. Amoureux de Sophie Marceau dans Une Rencontre (2014), meilleur ami de Vincent Cassel dans Un moment d'égarement (2015), l'acteur joue aussi un médecin de campagne dont les jours sont comptés (2016), un homme discret au cœur d'un complot politique dans La Mécanique de l'ombre (id.) et un braconnier amoureux de la nature dans L'Ecole buissonnière (2017).

Après avoir joué des personnages plutôt bienveillants dans Normandie nue, Le Collier rouge, Poly et La Brigade, François Cluzet surprend en contre-emploi dans le rôle d'un ignoble négationniste menant la vie dure à Jérémie Renier dans L'Homme de la cave. Il poursuit en incarnant un braqueur en cavale dans la comédie Canailles de Christophe Offenstein, dans laquelle il côtoie José Garcia.