Anaïs Demoustier se passionne dès son plus jeune âge pour la comédie. C’est dans cette optique qu’à l’âge de sept ans, elle suit des cours de théâtre, lui permettant ainsi de se faire remarquer par une directrice de casting pour jouer un petit rôle dans Le Monde de Marty (1999), dans lequel elle donne la réplique à Michel Serrault. Fermement décidée à réitérer cette formidable expérience cinématographique, la petite lilloise décroche en 2003 son premier rôle important, dans Le Temps du loup, un drame familial mis en scène par Michael Haneke, avec Isabelle Huppert et Béatrice Dalle dans les rôles principaux.

Sa carrière lancée, elle enchaîne ensuite les seconds rôles dans divers films, tels le drame Barrage en 2006, les comédies Le Prix à payer (avec Christian Clavier et Nathalie Baye) et Hellphone en 2007, ou encore la comédie dramatique Les Murs porteurs en 2008 (avec Miou-Miou et Charles Berling). Avec La belle personne en 2008, la comédienne tourne sous la direction de Christophe Honoré et côtoie la nouvelle génération d’acteurs français (Louis Garrel, Léa Seydoux), avant de s'imposer l'année suivante dans Sois sage, dans la peau d'une jeune femme à la recherche de son amour perdu.

En 2009, lors de la 34e cérémonie des César, Anaïs Demoustier est nommée dans la catégorie Meilleur espoir féminin pour sa prestation dans la comédie dramatique Les Grandes Personnes, qui confirme son parcours prometteur. En 2010, l’actrice est à l’affiche de trois films dramatiques : elle prête ses traits à une gamine débrouillarde recueillie par Pascal Greggory et Ludmila Mikaël dans L'Enfance du mal d'Olivier Coussemacq. Elle joue également une étudiante rencontrant un jeune homme vivant au jour le jour dans D'amour et d'eau fraîche d'Isabelle Czajka et se laisse à nouveau tenter par des marginaux dans Belle épine, aux côtés de Léa Seydoux qu'elle retrouve pour l'occasion.

En 2011, Anaïs Demoustier tourne pour Robert Guédiguian dans l'engagé Les Neiges du Kilimandjaro puis dans Elles et Thérèse Desqueyroux l'année suivante, la dernière oeuvre du réalisateur Claude Miller. 

L'année 2014 témoigne de la forte présence de cette jeune comédienne dans le paysage du cinéma français, puisqu'elle est à l'affiche de cinq longs métrages, dont la comédie romantique Situation amoureuse: c'est compliqué, primée au Festival de l'Alpe d'Huez. Elle fait aussi une incursion dans l'univers de la réalisatrice Pascale Ferran pour l'envoutant Bird People, retrouve Robert Guédiguian pour Au fil d'Arianne, et campe Claire dans le thriller amoureux de François Ozon Une nouvelle amie.

Très active, Anaïs Demoustier est attendue dans pas moins de trois films en 2015 : les comédies romantiques de Jérome Bonnell et Emmanuel Mouret, A trois, on y va et Caprice, ainsi que la nouvelle réalisation de Valérie Donzelli, Marguerite et Julien, adaptée d'un scénario rédigé par François Truffaut. L'année suivante, elle prend part au film d'époque adapté de deux romans de la comtesse de Ségur, Les Malheurs de Sophie, puis double le personnage principal du film d'animation La Jeune fille sans mains.

Aimant travailler avec les mêmes metteurs en scène, Anaïs Demoustier joue dans le drame familial La Villa et le drame social très ancré dans l'ère du temps Gloria Mundi de Guédiguian, ainsi que dans les déjantés Au poste ! et Incroyable mais vrai de Quentin Dupieux. Parallèlement, elle campe la femme du pompier défiguré Pierre Niney dans Sauver ou périr et donne des conseils au maire Fabrice Luchini dans Alice et le maire. En 2020, la native de Lille incarne une avocate dans le très froid La Fille au bracelet.

Adepte de nouveaux challenges, Anaïs Demoustier goûte au petit écran, comme ses prestations dans deux créations originales Canal+ en témoignent : Paris etc., une dramédie décalée signée Zabou Breitman sur "5 héroïnes du quotidien dans Paris", ainsi que Calls, qui retrace plusieurs enregistrements sonores retrouvés après de tragiques événements, tous connectés à une Apocalypse imminente.

En 2022, Anaïs mène l'enquête dans Novembre, sur les jours qui ont suivi les attentats du 13 novembre et campe l'une des protagonistes des loufoques Incroyable mais vrai et Fumer fait tousser de Quentin Dupieux.