Denis Podalydès, grandit à Versailles avec son frère le réalisateur Bruno Podalydès. Après deux années de classe préparatoire littéraire au lycée Fénélon en compagnie d’Emmanuel Bourdieu, il rentre au cours Florent avant d’intégrer rapidement le Conservatoire national supérieur d’art dramatique. En 1989, il fait une première apparition au cinéma dans Xenia. Mais c’est grâce au film Versailles rive gauche réalisé par son frère en 1991, qu’il prend conscience de son potentiel comique. Il poursuit par la suite sa collaboration avec son frère dans Dieu seul me voit (Versailles-chantiers) en 1997 et Liberté-Oléron en 2001.

Entre temps, il multiplie les rôles secondaires dans des comédies. On le retrouve ainsi dans Le Journal du séducteur (1995) de Danièle Dubroux, Rien sur Robert (1999) de Pascal Bonitzer. Cette orientation ne l'empêche pas de se tourner vers des projets un peu plus dramatiques comme Comment je me suis disputé... (ma vie sexuelle) (1996) d'Arnaud Desplechin ou Jeanne et le garçon formidable (1997) de Jacques Martineau et Olivier Ducastel. Il fait même une petite apparition dans Etat des lieux (1994), le premier film de Jean-Francois Richet.

Il obtient par la suite des rôles plus importants. Dans La Mort du Chinois et Les Frères Soeur, il partage la vedette avec José Garcia. En 2000 et 2001, on le retrouve dans des films dramatiques d'une plus grande envergure comme La Chambre des officiers de François Dupeyron et Laissez-passer de Bertrand Tavernier. En 2001, Denis Podalydès tient le rôle principal de Candidature, le premier moyen métrage d'Emmanuel Bourdieu. En 2002, il est le mari ruiné et suicidaire de Karin Viard dans Embrassez qui vous voudrez, le nouveau film de Michel Blanc. Pour ce rôle, il est nommé au César du meilleur second rôle. L'année suivante, il incarne le reporter Rouletabille dans Le Mystère de la chambre jaune, de son frère Bruno Podalydès.

Denis Podalydès tourne ensuite dans le premier film de Valeria Bruni Tedeschi, Il est plus facile pour un chameau..., avant de partager l'affiche avec Emmanuelle Devos dans Bienvenue en Suisse. En 2005, fort du succès du Mystère de la chambre jaune, il reprend le rôle de Rouletabille dans Le Parfum de la dame en noir toujours sous la direction de son frère. Il s'éloigne ensuite de la comédie le temps de deux films plus graves, Les Ames grises d'Yves Angelo, et Caché de Michael Haneke, pour mieux y revenir ensuite, devant les caméras de Valérie Lemercier dans Palais royal ! ou Marc Fitoussi pour La Vie d'artiste.

Après un bref détour par la case "superproduction internationale" avec le Da Vinci Code, Denis Podalydès poursuit cette alternance entre drame et comédie, qui le rend capable de passer du Temps des porte-plumes à Caos Calmo, ou de Coupable à Bancs publics (Versailles rive droite), troisième et dernier épisode de la "trilogie versaillaise" de son frère.

Parallèlement à son activité sur grand écran, il n’abandonne pas son premier amour : le théatre. Sociétaire de la Comédie-Française depuis 2000, il a mis en scène et joué dans de nombreuses pièces (comiques ou tragiques). En 2006, sa mise en scène de Cyrano de Bergerac reçoit des critiques élogieuses et joue à guichets fermés durant 2 ans. La pièce remporte 6 Molières dont celui de la mise en scène pour l'acteur. Il poursuit avec "Les Méfaits du tabac" d'Anton Tchekhov, "Lucrèce Borgia" de Victor Hugo, "Le Bourgeois gentilhomme" de Molière, "La Mort de Tintagiles" de Maurice Maeterlinck, "Les Fourberies de Scapin" de Molière et "Le Triomphe de l'amour" de Marivaux.

En 2009, au cinéma, il apparaît dans La Journée de la jupe aux côtés d'Isabelle Adjani et dans la comédie Neuilly sa mère ! où il incarne un bourgeois coincé. Deux ans plus tard, il interprète le rôle le plus impliquant de sa carrière, celui de Nicolas Sarkozy, dans La Conquête de Xavier Durringer présenté à Cannes, hors compétition, puis continue dans le film polémique en prêtant ses traits au controversé Pierre-Emmanuel Vaugrenard dans Omar m'a tuer. Il ne s'éloigne pas très longtemps de Cannes et de son festival, puisqu'il y revient en 2012 avec deux films, Vous n'avez encore rien vu d'Alain Resnais et Adieu Berthe ou l'enterrement de mémé, qui marque sa huitième collaboration avec son frère Bruno Podalydès.

Privilégiant la comédie et la comédie dramatique, Denis Podalydès incarne des personnages plus ou moins centraux dans Du vent dans mes mollets, Les Conquérants et Un village presque parfait. A noter sa prestation remarquable dans l'original Comme un avion de Bruno Podalydès, où il campe un quinquagénaire décidant de partir à l'aventure en kayak sur les rivières de France. L'acteur goûte également aux joies du thriller, comme en témoignent ses rôles dans L'Amour est un crime parfait et La Mécanique de l'ombre. Actif, il enchaîne avec Marie-Francine, Plaire, aimer et courir vite, Bécassine, Les Grands Esprits et Neuilly sa mère, sa mère, où il reprend son personnage de Stanislas de Chazelle.

Le natif de Versailles entame les années 2020 de manière intense. Pour preuve, il retouve une nouvelle fois son frère pour Les 2 Alfred et incarne le personnage principal de la très noire comédie Oranges sanguines et celui de Tromperie d'Arnaud Desplechin, un écrivain trompant sa femme avec Léa Seydoux.